【摘要】：我國(guó)擁有豐富的海洋資源,因?yàn)楹Ｑ蟮赜虻奶厥庑?海洋生物中油脂的化學(xué)特性、生物功能、結(jié)構(gòu)特性等方面與陸地生物脂類具有明顯的不同。但海洋生物中獲得天然脂類擁有很強(qiáng)的生理活性,存在很大的研究潛力。我國(guó)對(duì)海洋生物活性物質(zhì)的研究已取得很大的進(jìn)展�，F(xiàn)研究表明,海膽擁有很強(qiáng)的生物功能及其藥理活性,并在抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫活性等方面取得初步進(jìn)展。但海膽油脂的生理學(xué)功能這一方面的研究還有很大的空白。光棘球海膽,拉丁名為Strongylocentrotus nudus,民間稱之為大連紫海膽。海膽油脂(SUL)通過色譜氣質(zhì)分析脂肪酸的組成發(fā)現(xiàn),海膽油脂中脂肪酸含量豐富,其中含29種脂肪酸,其中對(duì)抗腫瘤活性存在潛在價(jià)值的PUFAω-3和ω-6各占31.83%和14.66%,具有潛在促其癌細(xì)胞凋亡的功能。EPA脂肪酸占比13.33%,DHA脂肪酸占比2.13%,文獻(xiàn)中明確提到這兩種PUFA存在抗腫瘤效果;在此基礎(chǔ)之上,本實(shí)驗(yàn)研究SUL協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞擴(kuò)增轉(zhuǎn)移五氟尿嘧啶(5-FU)對(duì)體外培養(yǎng)人類肝癌組織細(xì)胞(HepG2細(xì)胞)抗腫瘤活性的影響。采用MTBE法提取SUL,之后通過氣相色譜-質(zhì)譜中檢測(cè)到的各組分保留時(shí)間,以及與脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比,最后經(jīng)過NIST02庫(kù)檢索鑒定,分析得到脂肪酸的組成。以HepG2細(xì)胞模型測(cè)試SUL抗腫瘤能力,以不同濃度或不同處理時(shí)間的SUL作用于hepG2細(xì)胞,用MTT法、Hoechst33258對(duì)細(xì)胞殺傷能力進(jìn)行檢測(cè);通過活性氧(ROS)、總SOD酶活力和MDA含量檢測(cè)進(jìn)行抗氧化能力的檢測(cè);采用線粒體膜電位檢測(cè)法和FITC/PI雙染色法進(jìn)行檢測(cè),通過熒光倒置顯微鏡和流式細(xì)胞儀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,從而斷定SUL有促進(jìn)HepG2細(xì)胞抑制和凋亡的作用。MTBE法萃取分離的SUL,經(jīng)GC-MS分析得到,海膽油脂中飽和脂肪酸占比15.26%,單不飽和脂肪酸所占38.30%,多不飽和脂肪酸占比46.96%。HepG2細(xì)胞經(jīng)SUL誘導(dǎo)后細(xì)胞呈多種形態(tài),細(xì)胞漿收縮,核糖體、線粒體等細(xì)胞器聚集在一起,從而使得體積縮小,結(jié)構(gòu)更加緊密;染色質(zhì)逐漸聚集成新月狀,出現(xiàn)在核膜周邊,胞膜不斷分離出新的碎片,最終細(xì)胞變成多個(gè)形狀各異的由胞膜包裹的物體。MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)2.4 mg/mL,2.7 mg/mL,3.0 mg/mL,3.3 mg/mL濃度的SUL作用HepG2細(xì)胞均能抑制細(xì)胞增殖的作用。Hoechst33258染色法,對(duì)照組染色后發(fā)現(xiàn)胞核較大,細(xì)胞表面渾圓,光滑,胞核發(fā)散出清澈的藍(lán)色熒光,細(xì)胞核邊緣清楚。隨著加入的海膽油脂濃度的增大發(fā)生細(xì)胞的核破碎、細(xì)胞開始泯滅現(xiàn)象、脫壁死亡。且濃度越大此現(xiàn)象明顯。對(duì)于抗氧化的研究:檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ROS)、總SOD酶活力值、MDA含量3項(xiàng)指標(biāo),經(jīng)SPSS數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),延長(zhǎng)SUL的濃度或處理時(shí)間后發(fā)現(xiàn),O_2~-的含量在增加,大量文獻(xiàn)證實(shí)活性氧可強(qiáng)化caspase的表達(dá),從而指示腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,因此可以說明活性氧的增加也提高了誘導(dǎo)凋亡的能力。對(duì)于凋亡能力的檢測(cè):首先選用了JC-1線粒體膜電位檢測(cè)分析法,延長(zhǎng)加入海膽油脂后的培養(yǎng)時(shí)間,但不改變SUL濃度形況下發(fā)現(xiàn),細(xì)胞樣本中出現(xiàn)膜電位下降的細(xì)胞在增多,正常膜點(diǎn)位的細(xì)胞在減少。應(yīng)用imagineJ對(duì)圖片熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度的比值(紅色/綠色)在降低,表明了細(xì)胞的凋亡程度在加深;其次應(yīng)用了FITC/PI雙染色檢測(cè)法,不管是SUL的處理時(shí)間不同還是濃度的不同,根據(jù)細(xì)胞在圖像上的投影的趨勢(shì),可以看出細(xì)胞由正常細(xì)胞向早期凋亡遷移,最終到達(dá)晚期晚期的行走軌跡,所以可以確定海膽油脂在一步步促其凋亡,隨著SUL處理時(shí)間和濃度的推移凋亡的程度也在加劇。實(shí)驗(yàn)表明,這一發(fā)現(xiàn)表明SUL擁有抑制腫瘤細(xì)胞的能力;其次在探索抑制細(xì)胞途徑的道路上,SUL可以使細(xì)胞內(nèi)的活性氧的含量在增加,從而提升了細(xì)胞的凋亡能力;最后通過試劑盒檢測(cè)通過SUL的刺激使得凋亡現(xiàn)象確實(shí)存在,從而擁有抑制肝癌細(xì)胞的能力。從上述的實(shí)驗(yàn)總結(jié)來看,海膽油脂為腫瘤的預(yù)防或緩解提供一條新的研究方向,因此具備成為一種新型功能性食品的潛質(zhì)。
【圖文】：

圖 3.1 脂肪酸組成 GC-MS 色譜圖Fig 3.1 GC-MS spectrum of fatty acids-MS 所得的光譜圖 3.1 可知，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)所檢測(cè)到的脂肪酸達(dá)各組分的所占比值，均列于表 3.1。海膽油脂中三大類脂肪酸包飽和脂肪酸比和多不飽和脂肪酸，其所占的比例分別為 15.26%而 EPA 脂肪酸占比 15.65%，DHA 脂肪酸占比 2.55%，已經(jīng)證實(shí)這瘤效果。其中對(duì)抗腫瘤活性存在潛在價(jià)值的 PUFA ω-3 和ω-6 各占此前文獻(xiàn)中記載著應(yīng)用氯仿-甲醇法提取紫海膽黃中油脂的記錄，質(zhì)譜對(duì)脂肪酸組成進(jìn)行定性定量分析，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)與99]。同時(shí)符合多數(shù)海洋生物油脂組成的規(guī)律，不飽和與多不飽和。表 3.1 海膽油脂脂肪酸組成Table 3.1 GC-MS spectrum of fatty acids脂肪酸 脂肪酸占比（%）8.86±0.21

第三章 結(jié)果與討論值法檢測(cè)名為四甲基偶氮唑鹽，這是一種化合物又是一種染料，以從外部得到氫原子，因?yàn)榘麅?nèi)的線粒體中含有 SDH，反應(yīng)，，產(chǎn)物為甲月替，物理性質(zhì)在水溶液中溶解度很低，此反應(yīng)可以在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，而死細(xì)胞沒有這個(gè)功能。使甲月替晶體溶解。所以根據(jù)這一特性，可以根據(jù)熒光活細(xì)胞的程度。雖然不能定量分析，可以根據(jù)酶標(biāo)儀所檢算，便可以算出腫瘤細(xì)胞的活率，因此 MTT 法可以得到從而了解抗腫瘤材料對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。
【學(xué)位授予單位】：大連工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7;TS218

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 官福新;周露露;張宸豪;李妍;;JC-1單染法檢測(cè)CCCP對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位的影響[J];吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào);2014年05期

2 劉純慧;曹吉超;王鳳山;李平利;;海膽多糖的化學(xué)與藥理研究進(jìn)展[J];中國(guó)海洋藥物;2014年03期

3 和四梅;張麗莉;王藝?yán)?王國(guó)棟;;Caspase細(xì)胞凋亡通路及其在水生無脊椎動(dòng)物的研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通報(bào);2013年09期

4 劉曉婷;王延讓;張明;;線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J];環(huán)境與健康雜志;2013年02期

5 張杰;楊旭東;郝晶;李孟全;崔榮軍;王桂云;;白毛藤多糖誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的研究[J];中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng);2012年12期

6 邱小文;韋娜;蔣薇;劉慧;肖桂珍;譚澤威;黃英;王欽先;;n-6/n-3多不飽和脂肪酸不同比例對(duì)乳腺癌細(xì)胞膜脂組成和膜功能的影響[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2012年15期

7 陳曦;陳秀霞;陳強(qiáng);林能峰;;海洋生物活性物質(zhì)研究簡(jiǎn)述[J];福建農(nóng)業(yè)科技;2012年02期

8 孫靜文;莊則豪;;n-3多不飽和脂肪酸抗消化道腫瘤作用[J];廣東醫(yī)學(xué);2011年18期

9 李群珍;鄧紅;;二十二碳六烯酸增強(qiáng)5氟尿嘧啶對(duì)人肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性[J];現(xiàn)代消化及介入診療;2011年03期

10 陳巍魏;管曉翔;陳龍邦;;不同轉(zhuǎn)錄因子與p27~(Kip1)啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的時(shí)空順序?qū)ζ浔磉_(dá)的影響[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2011年02期

本文編號(hào)：2684676