【摘要】：第一章:NIPAL1在食管鱗狀細胞癌的臨床意義及其作用機制初步研究研究背景及目的食管癌是最常見的第八大癌癥類型,也是全球第六大常見癌癥相關死亡原因[1]。在美國和其他西方國家,約50%的食管癌是腺癌。然而,在亞洲國家,大約90%的食管癌是鱗狀細胞癌(SCC),并且SCC是食管癌的主要組織學亞型,占全世界所有食管癌的80%[2]。目前,與食管鱗癌侵襲及轉移相關的分子機制尚不清楚。因此,研究者們致力于深入挖掘這些有功能的生物標記物在食管鱗癌中發(fā)生發(fā)展機制,因為這些標記物可以使食管鱗狀細胞癌(ESCC)患者能更準確地分層,幫助臨床醫(yī)生做出最佳治療決策,從而改善患者預后。本課題組對3例ESCC患者的腫瘤組織及其癌旁正常食管上皮組織通過第二代深度測序技術進行全轉錄組測序。測序結果顯示NIPAL1是顯著下調基因之一,除了口腔鱗癌,NIPAL1在其他腫瘤中的表達及功能尚未有人報道。因此研究NIPAL1在食管鱗癌中的作用及機制是非常有必要的。研究方法1.臨床標本的收集:包括60例食管鱗癌患者新鮮組織標本和299例食管鱗癌患者石蠟包埋組織樣本。2.方法通過qRT-PCR檢測NIPAL1在60例食管鱗癌及其癌旁正常食管上皮組織中NIPAL1的表達情況;通過免疫組化檢測NIPAL1在299對食管癌組織芯片中的表達水平,并分析NIPAL1的表達水平與臨床病理特征及預后的相關性。通過慢病毒(Lentivirus)載體成功構建穩(wěn)定表達NIPAL1的食管癌細胞株EC109和EC9706。同時成功構建穩(wěn)定敲降NIPAL1(shRNA)的食管癌細胞株KYSE510,通過CCK-8細胞增殖實驗、平板克隆形成實驗和裸鼠皮下成瘤實驗研究NIPAL1對細胞體內外生長的影響;并通過transwell侵襲及遷移實驗和裸鼠尾靜脈肺轉移模型研究NIPAL1對細胞侵襲及遷移能力的影響;在NIPAL1分子機制研究中,我們應用western blotting、流式細胞術、F-actin、免疫熒光、JC-1、活細胞成像等實驗,分析并探討NIPAL1抑制腫瘤生長及轉移的機制。研究結果結果顯示NIPAL1在食管鱗癌組織及大部分細胞株中普遍表達降低。同時NIPAL1低表達與ESCC患者的臨床分期(TNM)、淋巴結轉移及預后顯著相關。體內外功能實驗顯示NIPAL1可有效抑制食管癌細胞增殖及遷移能力。機制研究結果顯示:1.NIPAL1通過負調控p-CDC2,使G2/M期發(fā)生阻滯;2.NIPAL1通過下調Bcl-2,促進細胞凋亡;3.NIPAL1通過負調控slug表達,抑制ESCC細胞的遷移;結論NIPAL1在食管鱗狀細胞癌中具有抑制腫瘤增殖及侵襲轉移的功能,通過阻滯細胞G2/M期,抑制細胞有絲分裂及減少細胞骨架中絲狀偽足和板狀偽足形成發(fā)揮抑癌基因作用。第二章:抑癌基因GRHL1在食管鱗狀細胞癌中臨床意義及功能初步研究研究背景及目的GRHL1是作為GRHL家族的成員主要編碼轉錄因子,既往研究表明GRHL1有抑制腫瘤細胞克隆形成,增殖及體內成瘤能力。本研究旨在評估GRHL1在食管鱗狀細胞癌(ESCC)中的表達和預后關系。研究方法通過定量RT-PCR,瓊脂糖凝膠電泳和Western印跡(Western Blotting,WB)等實驗檢測GRHL1在ESCC細胞系和臨床ESCC組織中的表達水平。對266例食管癌石蠟組織標本進行免疫組織化學染色,應用cox回歸分析GRHL1和臨床病理因素與患者的預后關系。通過構建GRHL1過表達及敲除的慢病毒載體評估GRHL1在ESCC細胞系中的功能。研究結果在大多數ESCC細胞系和臨床組織樣本中,GRHL1的mRNA和蛋白質水平都表達下調。GRHL1的低表達與腫瘤侵襲深度(P = 0.008),臨床分期(P =0.004)和患者死亡(P0.001)等因素具有相關性。此外,Kaplan-Meier生存曲線結果顯示,GRHL1的低表達的患者術后總生存期(Overall Survival,OS)顯著降低(log-rank test,P0.001,HR,2.073;95%CI,1.491-2.881)。此外,Cox多因素分析顯示,GRHL1低表達和腫瘤分化程度是ESCC患者獨立預后因素(均P0.05)。此外,GRHL1過表達細胞可發(fā)揮體外抑制ESCC細胞侵襲的能力,敲降GRHL1后ESCC的侵襲能力增強。結論GRHL1低表達與食管鱗癌患者預后較差相關,過表達GRHL1可抑制食管鱗癌細胞侵襲能力。GRHL1可作為一個獨立預后標志,并且有望成為治療ESCC的新型潛在靶點。
【圖文】：

邐第一章ＮＩＰＡＬ１在食管鱗狀細胞癌中的臨床意義及其作用機制初步研究邐逡逑為／進－步探究ＮＩＰＡＬ１低表達對食管淲癌患者預后的影響，我們通過單因逡逑素生存分析（ｌｏｇ邋－邋ｒａｎｋ邋ｔｅｓｔ邋）來繪制Ｋａｐｌａｎ邋－邋Ｍｅｉｅｒ生存曲線圖，結果顯示：逡逑ＮＩＰＡＬ１低表達組（ｎ邋＝邋１３４）患者的中位生存時間為１８個月，，而高表達組逡逑（ｎ邋＝邋１２３邋）患者的中位生存T間為２９個月，差異具有統(tǒng)計學意義（Ｐ＜邋０．００１，圖逡逑２）。逡逑除此之外，腫瘤分化程度（Ｐ＜０．００１）、淋巴結轉移（Ｐ＜０．００１）、腫瘤浸潤逡逑（Ｐ＜０．００１）、臨床分期（Ｐ＜０．００１）均與患者的總生存時間存在顯著的相關性，逡逑而其年齡與性別則與之無明顯關系（表２）。逡逑

第四ＦＩ開始，不一樣組別的細胞生長速度開始有顯著差異（Ｐ＜０．０００１邋），這意逡逑味著食管癌細胞的增殖受到過表達ＮＩＰＡＬｌ的抑制；將ＮＩＰＡＬ１敲降后，則能夠逡逑加快食管癌細胞的生長速率。見圖３－３逡逑３６逡逑
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.1

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本文編號：2683257