【摘要】：我國惡性腫瘤發(fā)病率持續(xù)上升,使我國居民飽受其患,不堪重負。食管癌是最為常見的消化道惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在世界范圍的惡性腫瘤中排第八位,死亡率占第五位。我國是食管癌高發(fā)國家,其中90%以上病理類型為鱗狀細胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC),因此食管鱗癌研究對我國居民健康具有重要意義。腫瘤細胞經(jīng)常發(fā)生表觀遺傳變異,改變腫瘤細胞表達的蛋白質庫。近年來研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細胞頻繁地激活只限于生殖細胞表達的基因。這些基因在正常組織中僅在生殖細胞表達,卻被癌細胞頻繁激活,來促進增殖轉移、抵抗凋亡等,因此這些基因被稱為癌/睪丸抗原cancer/testis antigens(CTAs)。PIWIL2蛋白也屬于癌/睪丸抗原。PIWIL2是Argonaute蛋白家族的成員,在睪丸組織中特異性表達,用來維持生殖細胞的發(fā)育和功能。近年來,研究證明在許多人和鼠的腫瘤組織中都有高表達PIWIL2,并與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關。但是在食管癌中PIWIL2如何影響癌癥進程并沒有明確的研究,因此本課題將對PIWIL2在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制進行研究。我們通過檢測食管癌樣本中PIWIL2的表達情況探究PIWIL2在食管癌中的臨床意義,并通過體內實驗、體外實驗明確PIWIL2對食管癌的影響及其作用機制。在40對食管癌組織中的PIWIL2的mRNA表達量顯著高于相對應的癌旁組織。同時,我們采用免疫組織化學技術和Westernblot技術檢測NMBzA誘導的大鼠食管癌模型中PIWIL2蛋白的表達量,證實從正常食管到異型增生再到食管癌整個發(fā)展過程,PIWIL2表達量逐步增加,說明其對食管癌的發(fā)生發(fā)展起到重要指示作用。體外細胞實驗證實過表達PIWIL2可增強食管癌細胞的增殖、侵襲、耐藥、裸鼠成瘤能力,并且增加了腫瘤干細胞比例。同時,在敲降PIWIL2的食管癌細胞系中得到同樣的證實。接下來,我們對過表達PIWIL2的KYSE30細胞及對照組細胞進行RNA測序,篩選出差異基因,并對其進行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析,富集到PI3K/Akt和TGF-[β信號通路以及干細胞多能性相關通路。Westernblot實驗結果顯示過表達PIWIL2的KYSE30細胞和KYSE150細胞中,p-Akt表達水平明顯升高,證實PIWIL2通過活化p-Akt表達從而激活PI3K/Akt信號通路,促進細胞增殖。并且PIWIL2激活TGF-β/Smad信號通路和促進基質金屬蛋白酶MMP14、MMP9的表達從而促進細胞發(fā)生上皮間質轉化EMT,促進侵襲轉移。我們還發(fā)現(xiàn)PIWIL2能夠上調干性轉錄因子Sox2、Oct4、Nanog、Bmi-1表達從而影響腫瘤干細胞的自我更新。綜上所述,PIWIL2在食管癌發(fā)生發(fā)展過程中起到促進作用,有可能成為食管癌的預后指標及治療靶點。間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSC)是成體干細胞中的一種,可以從多個組織中獲得。其中脂肪來源的間充質干細胞由于可從自體脂肪獲取、采集方便、取材損傷小、含量豐富、產(chǎn)量高等優(yōu)點,可滿足組織工程和疾病治療的需要,因此被廣泛應用于臨床和科學研究中。目前分離MSC的方法主要是用貼壁法分離MSC,但這樣分離的MSC是一個混雜的群體,其中的細胞可能具有不同增殖、分化和造血支持方面的能力。使用特定的表面或者細胞內標記,可以鑒別不同的MSC亞群。但是,目前的MSC亞群分類的研究主要集中于骨髓MSC,因此對于脂肪MSC的亞群研究有待于進一步開展。本研究成功從人脂肪組織中分離出脂肪間充質干細胞,具有成纖維細胞樣的形態(tài),并且成旋渦狀生長。流式細胞術和免疫熒光法均證實細胞表面標志物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105 呈陽性表達,CD31、CD34、CD45 呈陰性表達。用 RT-PCR方法證實干性基因Sox2、Oct4、Nanog的mRNA表達水平,脂肪間充質干細胞明顯高于成纖維細胞、食管癌細胞系KYSE150、宮頸癌細胞系Hela。MSC具有成脂肪、成骨、成軟骨多向分化能力。我們在研究中發(fā)現(xiàn),CD105的陽性率隨著代數(shù)的增加而遞減,而其他表面標志物指標則無變化,因此我們用CD105分選了 MSC,進一步研究CD105(+)MSC和CD105(-)MSC的差異。形態(tài)學觀察CD105(-)MSC細胞貼壁能力變差、逐漸懸浮脫落,細胞內容物增多不清晰透明,并且增殖減慢,群體倍增時間延長,并且更快走向衰老死亡,只能增殖到20代左右,而CD105(+)MSC能繼續(xù)增殖到38代。CD105(+)MSC干性基因Sox2、Oct4、Nanog的mRNA表達水平均高于CD105(-)MSC。CD105(+)MSC和CD105(-)MSC均能向成脂肪和成骨分化。MSC染色體核型分析,均為正常染色體核型,保證了其染色體水平的穩(wěn)定性。我們通過CD105分選出的MSC亞群實現(xiàn)了更加長期穩(wěn)定的培養(yǎng),并且通過染色體核型分析檢測了其安全性,為臨床應用和科學研究提供了重要的種子細胞。
【圖文】：

圖１－１、ＮＭＢｚＡ誘導大鼠食管癌動物模型病理結果逡逑（Ａ）正常大鼠食管上皮；（Ｂ）增生階段大鼠食管上皮；（Ｃ）輕度不典型增生階段大逡逑鼠食管上皮；（Ｄ）重度不典型增生階段大鼠食管上皮；（Ｅ）大鼠食管上皮乳頭瘤；逡逑

實驗結果逡逑在增生階段有弱陽性表達，在不典型增生階段ＰＩＷＩＬ２染色強度和陽性細胞百分率逡逑升高，到了食管癌階段，在整個食管上皮強表達。（圖１－２Ａ，Ｂ）同時，我們用逡逑Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ的方法檢測到同樣的結果（圖１－２Ｃ）。逡逑Ａ邐ＰＩＷＩＬ２逡逑Ｎｏｒｍａｌ邐Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ邐Ｄｙｓｐｌａｓｉａ邐Ｃａｒｃｉｎｏｍａ逡逑１５－１逡逑Ｂ邐＊＊逡逑Ｉ邐Ｔ逡逑（Ｏ逡逑ｉ５＇邋ｔ邋Ｉ逡逑。｜邋＋邐￣￣，，—逡逑／邋／邋／邋／逡逑ｃ邐ｉ－：邐＾￣￣—￣￣贏邋＾邋ｎ逡逑ＰＩＷＩＬ２邋＊逡逑ＧＡＰＤＨ邐ｍｍｍ逡逑ｆ邋０邐命逡逑圖１－２、ＰＩＷＩＬ２在大鼠食管癌組織中的蛋白表達水平逡逑３７逡逑
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.1

【參考文獻】

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1 殷德濤;李紅強;王勇飛;曹勝利;周玉冰;鄭立運;江金花;王慶端;;Piwil2在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及其與侵襲轉移的關系[J];中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2011年03期

本文編號：2683159