發(fā)布時(shí)間：2020-05-27 07:13

【摘要】：我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率持續(xù)上升,使我國(guó)居民飽受其患,不堪重負(fù)。食管癌是最為常見的消化道惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在世界范圍的惡性腫瘤中排第八位,死亡率占第五位。我國(guó)是食管癌高發(fā)國(guó)家,其中90%以上病理類型為鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC),因此食管鱗癌研究對(duì)我國(guó)居民健康具有重要意義。腫瘤細(xì)胞經(jīng)常發(fā)生表觀遺傳變異,改變腫瘤細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)庫(kù)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞頻繁地激活只限于生殖細(xì)胞表達(dá)的基因。這些基因在正常組織中僅在生殖細(xì)胞表達(dá),卻被癌細(xì)胞頻繁激活,來(lái)促進(jìn)增殖轉(zhuǎn)移、抵抗凋亡等,因此這些基因被稱為癌/睪丸抗原cancer/testis antigens(CTAs)。PIWIL2蛋白也屬于癌/睪丸抗原。PIWIL2是Argonaute蛋白家族的成員,在睪丸組織中特異性表達(dá),用來(lái)維持生殖細(xì)胞的發(fā)育和功能。近年來(lái),研究證明在許多人和鼠的腫瘤組織中都有高表達(dá)PIWIL2,并與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但是在食管癌中PIWIL2如何影響癌癥進(jìn)程并沒有明確的研究,因此本課題將對(duì)PIWIL2在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制進(jìn)行研究。我們通過(guò)檢測(cè)食管癌樣本中PIWIL2的表達(dá)情況探究PIWIL2在食管癌中的臨床意義,并通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、體外實(shí)驗(yàn)明確PIWIL2對(duì)食管癌的影響及其作用機(jī)制。在40對(duì)食管癌組織中的PIWIL2的mRNA表達(dá)量顯著高于相對(duì)應(yīng)的癌旁組織。同時(shí),我們采用免疫組織化學(xué)技術(shù)和Westernblot技術(shù)檢測(cè)NMBzA誘導(dǎo)的大鼠食管癌模型中PIWIL2蛋白的表達(dá)量,證實(shí)從正常食管到異型增生再到食管癌整個(gè)發(fā)展過(guò)程,PIWIL2表達(dá)量逐步增加,說(shuō)明其對(duì)食管癌的發(fā)生發(fā)展起到重要指示作用。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)過(guò)表達(dá)PIWIL2可增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲、耐藥、裸鼠成瘤能力,并且增加了腫瘤干細(xì)胞比例。同時(shí),在敲降PIWIL2的食管癌細(xì)胞系中得到同樣的證實(shí)。接下來(lái),我們對(duì)過(guò)表達(dá)PIWIL2的KYSE30細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行RNA測(cè)序,篩選出差異基因,并對(duì)其進(jìn)行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析,富集到PI3K/Akt和TGF-[β信號(hào)通路以及干細(xì)胞多能性相關(guān)通路。Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)PIWIL2的KYSE30細(xì)胞和KYSE150細(xì)胞中,p-Akt表達(dá)水平明顯升高,證實(shí)PIWIL2通過(guò)活化p-Akt表達(dá)從而激活PI3K/Akt信號(hào)通路,促進(jìn)細(xì)胞增殖。并且PIWIL2激活TGF-β/Smad信號(hào)通路和促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP14、MMP9的表達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化EMT,促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移。我們還發(fā)現(xiàn)PIWIL2能夠上調(diào)干性轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Oct4、Nanog、Bmi-1表達(dá)從而影響腫瘤干細(xì)胞的自我更新。綜上所述,PIWIL2在食管癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到促進(jìn)作用,有可能成為食管癌的預(yù)后指標(biāo)及治療靶點(diǎn)。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)是成體干細(xì)胞中的一種,可以從多個(gè)組織中獲得。其中脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞由于可從自體脂肪獲取、采集方便、取材損傷小、含量豐富、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn),可滿足組織工程和疾病治療的需要,因此被廣泛應(yīng)用于臨床和科學(xué)研究中。目前分離MSC的方法主要是用貼壁法分離MSC,但這樣分離的MSC是一個(gè)混雜的群體,其中的細(xì)胞可能具有不同增殖、分化和造血支持方面的能力。使用特定的表面或者細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記,可以鑒別不同的MSC亞群。但是,目前的MSC亞群分類的研究主要集中于骨髓MSC,因此對(duì)于脂肪MSC的亞群研究有待于進(jìn)一步開展。本研究成功從人脂肪組織中分離出脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,具有成纖維細(xì)胞樣的形態(tài),并且成旋渦狀生長(zhǎng)。流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光法均證實(shí)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105 呈陽(yáng)性表達(dá),CD31、CD34、CD45 呈陰性表達(dá)。用 RT-PCR方法證實(shí)干性基因Sox2、Oct4、Nanog的mRNA表達(dá)水平,脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞明顯高于成纖維細(xì)胞、食管癌細(xì)胞系KYSE150、宮頸癌細(xì)胞系Hela。MSC具有成脂肪、成骨、成軟骨多向分化能力。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn),CD105的陽(yáng)性率隨著代數(shù)的增加而遞減,而其他表面標(biāo)志物指標(biāo)則無(wú)變化,因此我們用CD105分選了 MSC,進(jìn)一步研究CD105(+)MSC和CD105(-)MSC的差異。形態(tài)學(xué)觀察CD105(-)MSC細(xì)胞貼壁能力變差、逐漸懸浮脫落,細(xì)胞內(nèi)容物增多不清晰透明,并且增殖減慢,群體倍增時(shí)間延長(zhǎng),并且更快走向衰老死亡,只能增殖到20代左右,而CD105(+)MSC能繼續(xù)增殖到38代。CD105(+)MSC干性基因Sox2、Oct4、Nanog的mRNA表達(dá)水平均高于CD105(-)MSC。CD105(+)MSC和CD105(-)MSC均能向成脂肪和成骨分化。MSC染色體核型分析,均為正常染色體核型,保證了其染色體水平的穩(wěn)定性。我們通過(guò)CD105分選出的MSC亞群實(shí)現(xiàn)了更加長(zhǎng)期穩(wěn)定的培養(yǎng),并且通過(guò)染色體核型分析檢測(cè)了其安全性,為臨床應(yīng)用和科學(xué)研究提供了重要的種子細(xì)胞。
【圖文】：

圖１－１、ＮＭＢｚＡ誘導(dǎo)大鼠食管癌動(dòng)物模型病理結(jié)果逡逑（Ａ）正常大鼠食管上皮；（Ｂ）增生階段大鼠食管上皮；（Ｃ）輕度不典型增生階段大逡逑鼠食管上皮；（Ｄ）重度不典型增生階段大鼠食管上皮；（Ｅ）大鼠食管上皮乳頭瘤；逡逑

實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑在增生階段有弱陽(yáng)性表達(dá)，在不典型增生階段ＰＩＷＩＬ２染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率逡逑升高，到了食管癌階段，在整個(gè)食管上皮強(qiáng)表達(dá)。（圖１－２Ａ，Ｂ）同時(shí)，我們用逡逑Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ的方法檢測(cè)到同樣的結(jié)果（圖１－２Ｃ）。逡逑Ａ邐ＰＩＷＩＬ２逡逑Ｎｏｒｍａｌ邐Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ邐Ｄｙｓｐｌａｓｉａ邐Ｃａｒｃｉｎｏｍａ逡逑１５－１逡逑Ｂ邐＊＊逡逑Ｉ邐Ｔ逡逑（Ｏ逡逑ｉ５＇邋ｔ邋Ｉ逡逑。｜邋＋邐￣￣，，—逡逑／邋／邋／邋／逡逑ｃ邐ｉ－：邐＾￣￣—￣￣贏邋＾邋ｎ逡逑ＰＩＷＩＬ２邋＊逡逑ＧＡＰＤＨ邐ｍｍｍ逡逑ｆ邋０邐命逡逑圖１－２、ＰＩＷＩＬ２在大鼠食管癌組織中的蛋白表達(dá)水平逡逑３７逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 殷德濤;李紅強(qiáng);王勇飛;曹勝利;周玉冰;鄭立運(yùn);江金花;王慶端;;Piwil2在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及其與侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J];中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2011年03期

本文編號(hào)：2683159