【摘要】：目的:研究吲哚胺2,3-雙加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)在乳腺癌患者新輔助化療前局部腫瘤組織中的表達以及外周血中的活性,尋找二者間的關(guān)系,同時結(jié)合患者臨床病理資料進行分析,明確化療前腫瘤組織中IDO表達及外周血中IDO活性與新輔助化療療效有無相關(guān)性,為臨床預測化療是否敏感提供一定信息。建立人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231及SKBR-3的紫杉醇(paclitaxel,PTX)耐藥細胞系,檢測各細胞系中IDO蛋白表達、IDO酶活性及IDO mRNA表達水平,探究乳腺癌細胞紫杉醇耐藥后IDO在蛋白及基因水平的變化趨勢,為惡性腫瘤化療耐藥后制定治療方案提供新的依據(jù)。方法:1、收集2015年9月至2016年12月在天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院接受新輔助化療的53例乳腺癌患者的局部腫瘤組織粗針穿刺標本和外周血標本。免疫組織化學染色法檢測新輔助化療前局部腫瘤組織中IDO蛋白表達情況;高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography,HPLC)檢測化療前外周血中色氨酸(tryptophan,Trp)、犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)濃度并用Kyn/Trp比值評估外周血中IDO活性。分析IDO表達及活性與新輔助化療療效的相關(guān)性。2、以PTX為誘導藥物,采用間歇誘導法建立MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX及SKBR-3/PTX耐藥細胞系。采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法檢測乳腺癌原始細胞及PTX耐藥細胞對PTX的耐藥性,計算各個細胞系的半數(shù)抑制濃度(50%inhibitory concentration,IC50)。3、采用Western blots、高效液相色譜法及RT-PCR技術(shù)檢測乳腺癌原始細胞(MCF-7、MDA-MB-231及SKBR-3)和乳腺癌PTX耐藥細胞(MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX及SKBR-3/PTX)中IDO蛋白表達、IDO酶活性水平及IDO mRNA表達水平。結(jié)果:1、在53例乳腺癌患者中,有28例(52.83%)患者新輔助化療前腫瘤組織中IDO呈高表達。新輔助化療前腫瘤組織中IDO表達隨著臨床T分期(P=0.006)、N分期(P=0.020)、臨床分期(P=0.045)的增高而增加,且ER陽性者IDO高表達(P=0.014)。2、53例乳腺癌患者新輔助化療前外周血中IDO平均活性為0.044±0.015。新輔助化療前外周血中IDO活性隨著臨床T分期(P=0.019)和N分期的增高而提高(P=0.047)。3、乳腺癌新輔助化療前腫瘤組織中IDO高表達患者,其外周血中IDO活性較高(P=0.004)。并且新輔助化療前腫瘤組織中IDO表達及外周血中IDO活性均與新輔助化療臨床療效及病理完全緩解(pathologic complete response,pCR)有關(guān)(P0.05)。多因素分析顯示新輔助化療前外周血中IDO活性是影響pCR的唯一獨立因素(P=0.032)。4、建立PTX耐藥終濃度為500nM的MCF-7/PTX、200nM的MDA-MB-231/PTX及200nM的SKBR-3/PTX的耐藥細胞系。CCK-8法檢測細胞耐藥性顯示MCF-7、MDA-MB-231及SKBR-3三個細胞系的原始和PTX耐藥細胞間的IC50具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。5、Western blots檢測示:對比乳腺癌原始細胞,在PTX耐藥細胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX及SKBR-3/PTX中IDO蛋白表達均增強。6、高效液相色譜法分析顯示:對比乳腺癌原始細胞,在PTX耐藥細胞MCF-7/PTX,MDA-MB-231/PTX及SKBR-3/PTX中,IDO酶活性明顯增高(P0.05),差異具有統(tǒng)計學意義。7、RT-PCR檢測示:對比乳腺癌原始細胞,在PTX耐藥細胞MCF-7/PTX,MDA-MB-231/PTX及SKBR-3/PTX中,IDO mRNA的表達水平均明顯提高(P0.05),差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)論:1、乳腺癌患者新輔助化療前外周血中IDO高活性伴隨腫瘤組織中IDO高表達,外周血IDO活性可以提示腫瘤局部IDO的表達水平。同時新輔助化療前腫瘤組織中IDO表達及外周血中IDO活性與腫瘤體積大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。2、乳腺癌患者新輔助化療前腫瘤組織中IDO表達和外周血中IDO活性與新輔助化療療效相關(guān),臨床化療效果不敏感患者及未到達pCR患者化療前腫瘤組織中IDO高表達、外周血中IDO高活性,可以為臨床預測化療是否敏感提供一定信息。3、在對紫杉醇耐藥的乳腺癌細胞中,IDO蛋白表達增強、IDO酶活性增高及IDO mRNA表達水平提高,明確乳腺癌化療耐藥細胞中的IDO變化趨勢可以為惡性腫瘤化療耐藥后制定治療方案提供新的依據(jù)。
【圖文】：

5）進樣量：20 μL。（2）標準溶液1）犬尿氨酸標準儲備液：200μg/mL。2）色氨酸標準儲備液：400μg/mL 色氨酸標準儲備液，二者均放入冰箱備用。（3）樣品的處理：將血清加入等體積的高氯酸溶液（體積分數(shù) 5%）中，離心混勻，室溫放置 10min，10000rmp×2min 離心，取 20μL 上清液進樣分析。（4）血清中犬尿氨酸及色氨酸濃度的計算犬尿氨酸及色氨酸濃度采用外標法測定峰面積進行定量分析，數(shù)據(jù)由 Anstar色譜工作站處理完成。外周血中 Kyn 的濃度（μmol/L）=血清中 Kyn 的峰面積/標準液中 Kyn 的峰面積×標準液中 Kyn 的濃度×2。外周血中 Trp 的濃度參照上式計算。（5）結(jié)果分析1）標準品和外周血樣品的色譜分離圖：Kyn 和 Trp 保留時間分別 8.65min 和16.55min 左右，二者分離良好。圖 1-1a 和圖 1-1b 分別是混合標準工作液和人外周血樣品的色譜分離圖。

色譜工作站處理完成。外周血中 Kyn 的濃度（μmol/L）=血清中 Kyn 的峰面積/標準液中 Kyn 的峰面積×標準液中 Kyn 的濃度×2。外周血中 Trp 的濃度參照上式計算。（5）結(jié)果分析1）標準品和外周血樣品的色譜分離圖：Kyn 和 Trp 保留時間分別 8.65min 和16.55min 左右，二者分離良好。圖 1-1a 和圖 1-1b 分別是混合標準工作液和人外周血樣品的色譜分離圖。圖 1-1a 混合標準工作液中 Kyn 和 Trp 分離曲線
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9

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本文編號：2682642