【摘要】：研究背景:結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展機制目前尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細胞物質(zhì)代謝和相關(guān)酶學(xué)的改變在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的促進作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn),糖原代謝是腫瘤細胞的一種普遍的物質(zhì)代謝途徑,而調(diào)控糖原分解代謝的糖原磷酸化酶(GP),尤其是肝型糖原磷酸化酶(PYGL)的異常表達,可能與腫瘤的進展有關(guān)。既往的研究已發(fā)現(xiàn),結(jié)直腸癌組織中的糖原含量與其腫瘤體積及細胞增殖率呈負相關(guān),即結(jié)直腸癌組織內(nèi)糖原水平越高,腫瘤體積越小,腫瘤細胞增殖率越低。這提示結(jié)直腸癌細胞可通過分解利用糖原來促進其惡性增殖。但是,目前對于調(diào)控糖原分解的關(guān)鍵酶GP,尤其是PYGL,在結(jié)直腸癌中的表達以及其對結(jié)直腸癌糖原代謝和腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響尚不十分清楚。目的:檢測結(jié)直腸癌組織PYGL及其同工酶腦型糖原磷酸化酶(PYGB)的表達情況,分析PYGL和PYGB的差異性表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征以及預(yù)后的關(guān)系,明確PYGL在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用;研究PYGL在不同的結(jié)腸癌細胞株中的表達情況,探討PYGL表達對結(jié)腸癌細胞內(nèi)糖原代謝水平的調(diào)控作用;研究PYGL的表達對結(jié)腸癌細胞增殖、遷移能力的影響。方法:①納入解放軍總醫(yī)院從2009年1月至2010年6月行手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織110例,取對應(yīng)的癌旁組織作為對照。采用免疫組織化學(xué)的方法檢測PYGL和PYGB在癌組織及癌旁組織中的表達差異。②采用WB的方法檢測結(jié)腸癌細胞株和正常結(jié)腸細胞系中PYGL的表達情況。設(shè)計三組PYGL-siRNAs(siRNA-1281、siRNA-343、siRNA-640)沉默HCT116 細胞,用 WB 篩選出沉默效率最高的片段,并作為靶基因構(gòu)建慢病毒載體,包裝慢病毒,感染HCT116細胞株并篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。③用酶聯(lián)比色法檢測細胞內(nèi)糖原水平,流式細胞儀檢測細胞活性氧(ROS)水平,并分別用MTT法和Transwell法檢測細胞增殖和遷移能力。結(jié)果:①PYGL和PYGB在結(jié)直腸癌組織中的表達率均顯著高于其在癌旁組織中的表達率(P0.01),PYGL的表達與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及OS有關(guān),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病人PYGL的陽性表達率較高(P0.01),COX單因素和多因素分析均顯示PYGL表達陽性的患者OS較短(P0.01);PYGB在分化程度好的結(jié)直腸癌組織中的表達率顯著高于其在分化程度差的癌組織中的表達率(P0.01),PYGB的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和OS無關(guān)(P0.05)。這提示PYGL可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。②PYGL在結(jié)腸癌細胞株HCT116、SW480、CaC02均有表達,而在正常結(jié)腸細胞株NCM46不表達。篩選出沉默效率最高的siRNA-640作為靶基因序列,用于構(gòu)建慢病毒載體,WB檢測shRNA可有效下調(diào)HCT116細胞中PYGL表達水平。③實驗組HCT116細胞(shPYGL)與空載組(shCtr)和空白對照組比較,其細胞內(nèi)糖原水平(32.6±4.7 vs 14.9±1.7vs 12.7±0.73ng/ul,P0.01)和 ROS 水平(DCF 熒光相對強度:45.7±4.1 vs 11.8±3.3 vs 3.9±1.0,P0.01),均明顯上升。shPYGL 組細胞在第 2(0.35±0.02 vs 0.57±0.01 vs0.54±0.02,P0.01),3(0.41±0.01 vs0.75±0.04 vs 0.75±0.05,P0.01),4(0.50±0.04vs0.86±0.02vs0.86±0.03,P0.01)天的吸光度(od)值,及穿過 transwell 膜的數(shù)目(37.00±5.29 vs 96.67士11.55 vs 103.33±7.02,P0.01),與shCtr組和空白對照組比較,均明顯降低,提示抑制PYGL,可抑制結(jié)腸癌細胞的增殖和遷移能力。結(jié)論:結(jié)直腸癌癌組織中PYGL表達水平上調(diào),PYGL的表達水平上調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后差相關(guān);PYGL的高表達能夠有效促進結(jié)腸癌細胞對糖原的利用,并降低結(jié)腸癌細胞內(nèi)活性氧水平;PYGL通過動員糖原分解,促進了結(jié)腸癌細胞的生長和增殖,提高了結(jié)腸癌細胞的遷移能力,可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生與轉(zhuǎn)移機制有關(guān)。
【圖文】：

可見ＴＩＬ初始分離時呈半懸浮生長，體外活化擴增后，細胞形態(tài)出現(xiàn)分支逡逑桿狀，數(shù)量增多，呈集落樣生長，細胞增殖活躍。ＨＥ染色未見腫瘤細胞，說明分逡逑離的ＴＩＬ細胞純度良好（圖１．３邋Ｄ）。逡逑１．３．４光鏡觀察自體腫瘤細胞逡逑大部分獲得的自體腫瘤細胞（胃癌原代細胞）可在２４ｈ內(nèi)貼壁，形態(tài)多為圓逡逑形、橢圓形、類圓形，原代細胞多成團生長。在高倍顯微鏡下可以觀察到胃癌原逡逑代細胞的細胞核增大，核漿比例失調(diào)，有時可見細胞核分裂，多為細胞分裂旺盛逡逑時。自體腫瘤細胞ＨＥ染色可見腫瘤細胞的胞漿內(nèi)含有少量漿液或粘液（圖１．４邋Ｂ）。逡逑２７逡逑

邐－逡逑焌Ｖ：逡逑圖１．４體外培養(yǎng)１４ｄ光鏡下觀察自體腫瘤細胞（Ａ）邋ｘｌ00；邋（Ｂ）邋ＨＥ染色，，ｘ２00逡逑１．３．５邋ＴＩＬ體外活化擴增前后淋巴細胞亞群比例變化逡逑初始分離的ＴＩＬ細胞經(jīng)體外ＩＬ－２、ＣＤ３邋ＭｃＡｂ、ＣＤ２８邋ＭｃＡｂ等細胞因子刺激逡逑活化擴X棧保刺旌笫棧癯墑歟裕桑滔赴�。同时应用留|較赴羌觳馓逋饣罨┰鑾板義蝦螅裕桑滔赴謀硇�，进而探鍝梧养扩澡幇后ＴＩＬ细胞褍S罕壤謀浠Ａ魘澆峁義舷允荊跏擠擲氳膩澹裕桑體逑赴澹茫模常�、ＣＤ３＋ＣＤ８＋、ＣＤ３－ＣＤ＋、ＣＤ３＋ＣＤ４＋、辶x希茫模常茫模矗茫模玻擔疲錚校常赴僑罕壤直鷂澹福保

本文編號：2681105