【摘要】：目的:結(jié)直腸癌(CRC)是發(fā)病率較高的腫瘤之一,為提高治療效果,尋找結(jié)CRC的早期診斷標(biāo)志物或分子靶標(biāo)顯得尤為重要。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是非編碼RNA中的一類,與許多疾病有關(guān),尤其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。己有初步研究表明lncRNAGAPLINC與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究將利用公共數(shù)據(jù)庫的RNA序列(RNA-seq)數(shù)據(jù)資源,分析lncRNA在CRC組織中的表達(dá)特征及其在預(yù)后判斷方面的潛在價值,并進(jìn)一步研究GAPLINC在CRC發(fā)生發(fā)展過程的作用機(jī)制,探討其潛在的臨床應(yīng)用價值。方法:下載腫瘤基因圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫中CRC相關(guān)的RNA-seq數(shù)據(jù),進(jìn)行l(wèi)ncRNA表達(dá)差異、功能、通路富集及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析,同時分析lncRNA差異表達(dá)對CRC患者預(yù)后的影響;利用lncRNAPCR芯片篩選3對CRC標(biāo)本的癌組織和對應(yīng)的癌旁組織差異表達(dá)的lncRNA;確定目標(biāo)lncRNA GAPLINC后,對21對臨床標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證;培養(yǎng)CRC株(HCT116),構(gòu)建GAPLINC表達(dá)質(zhì)粒和合成siRNA轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞,研究其對HCT116細(xì)胞遷移、侵襲及凋亡的影響;核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)確定GAPLINC在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的表達(dá)情況,生物信息學(xué)方法預(yù)測與GAPLINC結(jié)合的miRNA,RNA pull-down及熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)確定目標(biāo)miRNA,并對21對臨床標(biāo)本驗(yàn)證其相關(guān)性,同時構(gòu)建目標(biāo)miRNA mimics轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞,觀察其對腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力及細(xì)胞凋亡的影響;通過生物信息學(xué)方法預(yù)測目標(biāo)miRNA調(diào)控靶基因,RT-qPCR和WB檢測抑制GAPLINC和增加miR-34a的表達(dá)對靶基因表達(dá)的影響;同時通過RT-qPCR檢測21對臨床標(biāo)本的靶基因與目標(biāo)miRNA和GAPLINC表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果:對TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果提示有119個lncRNA存在差異性表達(dá),lncRNA和編碼基因(coding gene)存在共表達(dá)關(guān)系,對基因富集性分析發(fā)現(xiàn),lncRNA參與細(xì)胞的多個生物學(xué)行為,lncRNA-miRNA-mRNA存在密切的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),其中16個lncRNA對患者生存預(yù)后顯著相關(guān)。LncRNAPCR芯片結(jié)果表明,CRC組織中存在較多的lncRNA表達(dá)異常,其中GAPLINC在CRC中表達(dá)表達(dá)量顯著高于正常對照組織;21對臨床標(biāo)本也證實(shí)CAPLINC在腫瘤組織的表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織;培養(yǎng)HCT116細(xì)胞,GAPLINC的過度表達(dá)可增加HCT116細(xì)胞的遷移和侵襲能力,同時抑制細(xì)胞凋亡,抑制GAPLINC的表達(dá)則出現(xiàn)相反的現(xiàn)象;核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)表明GAPLINC主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)后,根據(jù)生物信息學(xué)方法預(yù)測10個可能與GAPLINC結(jié)合且與CRC發(fā)病相關(guān)的miRNA,RNApull-down和熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-34a為目標(biāo)miRNA;21對臨床樣本RT-qRCR亦證實(shí)GAPLINC與miR-34a的表達(dá)顯著負(fù)相關(guān);將miR-34 mimics轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞或與GAPLINC表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞,結(jié)果表明miR-34a mimics可降低腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力,抵消部分GAPLINC的作用;預(yù)測miR-34a靶基因,確定c-MET為miR-3a調(diào)控的靶基因,HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染GAPLINC siRNA和miR-34a mimics后均可使c-MET的表達(dá)量降低;臨床標(biāo)本證實(shí)miR-34a與c-MET的表達(dá)顯著負(fù)相關(guān),同時GAPLINC與c-MET的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。結(jié)論:生物信息學(xué)分析顯示lncRNA在CRC發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用,參與多個生物學(xué)行為,對CRC患者預(yù)后判斷及實(shí)驗(yàn)設(shè)計具有一定指導(dǎo)意義;其中GAPLINC其具有促進(jìn)CRC細(xì)胞的遷移、侵襲,同時抑制細(xì)胞凋亡的作用,從而發(fā)揮其致癌作用;其主要作用機(jī)制為通過競爭性結(jié)合miR-34a,進(jìn)而影響c-MET的表達(dá),實(shí)現(xiàn)對腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控,在CRC診斷及靶向治療等方面具有潛在的臨床意義。
【圖文】：

前言逡逑（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，，邋ｎｔ），其具有與編碼ＲＮＡ基因類似的特征，如ＲＮＡ多聚酶ＩＩ介導(dǎo)轉(zhuǎn)逡逑錄、５’端帽、剪切加工、多個外顯子、３’多聚腺苷酸（ｐｏｌｙ－Ａ）、轉(zhuǎn)錄位置的組蛋逡逑白邋３邋第邋４邋位賴氨酸邋３邋甲基化（ｈｉｓｔｏｎｅ邋３，邋ｌｙｓｉｎｅ邋４邋ｔｒｉ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，Ｈ３Ｋ４邋ｍｅ３）等，但逡逑其與編碼ＲＮＡ基因存在若干差異，如缺少編碼區(qū)或編碼區(qū)長度比較短；缺少開逡逑放閱讀框架（ｏｐｅｎ邋ｒｅａｄｉｎｇ邋ｆｒａｍｅｓ，邋ＯＲＦｓ），或ＯＲＦｓ無功能性；不包含己知蛋白結(jié)逡逑構(gòu)域或基因序列內(nèi)不存在蛋白數(shù)據(jù)庫記錄的類似序列片段等。然而，ＩｎｃＲＮＡ并逡逑非無任何編碼能力，部分ＩｎｃＲＮＡ可表現(xiàn)為低編碼能力，可翻譯成少量的短肽，逡逑或翻譯的短肽被迅速降解？Ｇ］。基于傳統(tǒng)的理論和大部分轉(zhuǎn)錄啟動的情況，逡逑ＩｎｃＲＮＡ被認(rèn)為是無效的轉(zhuǎn)錄，是ＤＮＡ轉(zhuǎn)錄的“噪點(diǎn)”［１Ｕ２］。但目前已有研究表逡逑明，ＩｎｃＲＮＡ結(jié)構(gòu)復(fù)雜，功能較為豐富，在調(diào)控基因表達(dá)方面起著重要作用，其逡逑種類包括基因組間ＩｎｃＲＮＡ、內(nèi)含子（基因內(nèi)）ＩｎｃＲＮＡ、順式或反式ＩｎｃＲＮＡ（圖逡逑１）。逡逑

博士學(xué)位論文邐逡逑顯得微不足道，其吸附ｍｉＲＮＡ的量也有限，最終對ｍＲＮＡ的翻譯造成多逡逑響仍有待探討［３３］。然而，ＩｎｃＲＮＡ的ＣｅＲＮＡ現(xiàn)象在腫瘤細(xì)胞中廣泛存在，逡逑明很多腫瘤的發(fā)病機(jī)制，因此，目前ＩｎｃＲＮＡ的ＣｅＲＮＡ作用機(jī)制仍是主要逡逑熱點(diǎn)之一。逡逑綜上所述，ＩｎｃＲＮＡ的功能復(fù)雜，并非ＤＮＡ的無效轉(zhuǎn)錄，其主要作用機(jī)制如逡逑圖所示。逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.34

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本文編號：2680582