發(fā)布時(shí)間：2020-05-25 16:37

【摘要】：研究背景及目的:惡性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是由黑色素細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的惡性腫瘤。黑色素細(xì)胞是由神經(jīng)嵴分化而來(lái),因此MM發(fā)生在由神經(jīng)嵴細(xì)胞分化的組織或器官上,如口腔、鼻腔、胃腸道黏膜、顱腦等部位,但MM發(fā)生率最高的器官還是皮膚。惡性黑色素瘤的發(fā)病率因人種的不同和生活地區(qū)紫外線強(qiáng)度的不同而出現(xiàn)差異性。黑色素是由色素細(xì)胞產(chǎn)生,用來(lái)保護(hù)皮膚免受紫外線的損傷。有數(shù)據(jù)顯示高加索人的MM發(fā)病率明顯高于非洲人及亞洲人,同種皮膚顏色下生活中紫外線照射強(qiáng)的地區(qū)MM的發(fā)病率高。對(duì)色素痣的刺激及不正確處理也是MM發(fā)生的誘因之一。我國(guó)人民對(duì)惡性黑色素瘤的認(rèn)識(shí)普遍不高,長(zhǎng)期戶外工作者沒(méi)有有效的自我防護(hù),減少紫外線對(duì)皮膚的損傷,尤其對(duì)足底、腰部、口腔黏膜等其他易刺激部位的色素痣沒(méi)有足夠的保護(hù)。加之對(duì)色素痣的不正確處理如:反復(fù)摩擦、化學(xué)藥物、冷凍、不徹底的切除等均可誘發(fā)色素痣的惡變。當(dāng)患者發(fā)現(xiàn)皮膚出現(xiàn)破潰,或腫塊時(shí)才到醫(yī)院就診,此時(shí)惡性黑色素瘤往往已出現(xiàn)周圍組織浸潤(rùn),和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,失去了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)。有數(shù)據(jù)顯示0期MM的5年生存率為97%,IV期MM的5年生存率僅為10%。我國(guó)的MM發(fā)病率雖然不高,約占全身惡性腫瘤的4%~5%,但死亡率卻在所有皮膚腫瘤中排名第一,我國(guó)MM的5年生存率不足10%。對(duì)早期惡性黑色素瘤沒(méi)有有效的篩查手段,也是MM患者生存率不高的原因之一。因此從基因?qū)W角度對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行研究,尋找有效的生物靶點(diǎn),是提高早期惡性黑色素瘤的診斷率的重要方法,同時(shí)有效的生物靶點(diǎn),也可為MM的治療及預(yù)后判斷提供全新的臨床思路。方法:高內(nèi)涵基因功能篩選平臺(tái),篩選在黑色素瘤細(xì)胞中的新功能陽(yáng)性基因HSDL2。構(gòu)建針對(duì)HSDL2基因不同靶點(diǎn)的RNA感染慢病毒載體,在工具細(xì)胞293T中,進(jìn)行Western Blot外源驗(yàn)證靶點(diǎn)有效性,篩選出有效靶點(diǎn)。?使用qPCR方法檢測(cè)HSDL2基因在不同工具細(xì)胞中mRNA均有高豐富度表達(dá)。?以HSDL2基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)RNA干擾靶點(diǎn)及雙鏈DNA oligo制備,并構(gòu)建慢病毒載體。?在體外感A375(人惡性黑色瘤細(xì)胞),使之敲除腫瘤細(xì)胞HSDL2基因,篩選后構(gòu)建HSDL2缺陷的A375穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞珠。(4)qPCR檢測(cè)HSDL2基因在mRNA水平的基因敲減率。(5)對(duì)shHSDL2(A375細(xì)胞、加HSDL2基因shRNA病毒感染的細(xì)胞組)進(jìn)行Celigo細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)、MTT檢測(cè)、PI-FACS細(xì)胞周期檢測(cè)、Annexin V-APC單染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)。結(jié)果:1.經(jīng)shRNA慢病毒感染后,qPCR方法檢測(cè)m RNA水平上實(shí)驗(yàn)組A375細(xì)胞中HSDL2基因表達(dá)量受到明顯抑制(p0.05),敲減效率達(dá)到90.8%。2.細(xì)胞生長(zhǎng)檢測(cè)表明:shHSDL2組(正常A375細(xì)胞、加HSDL2基因shRNA病毒感染的細(xì)胞組)與shCtrl組(正常A375細(xì)胞、加陰性對(duì)照病毒感染的細(xì)胞)相比,增殖抑制明顯。3.MTT檢測(cè)結(jié)果表明:相比shCtrl組,shHSDL2組細(xì)胞增殖減緩。4.細(xì)胞周期檢測(cè)表明:shHSDL2組處于S期的細(xì)胞增多(P0.05),處于G1期的細(xì)胞增多(P0.05),處于G2/M期的細(xì)胞減少(P0.05)。5.凋亡檢測(cè):相比shCtrl組,shHSDL2組凋亡數(shù)增多(P0.05)。結(jié)論:干擾目的基因HSDL2可有效降低黑色素瘤細(xì)胞A375胞活性、抑制細(xì)胞增值、促進(jìn)細(xì)胞凋亡,其可能是MM的有效分子生物靶點(diǎn),為臨床MM的診斷、治療、預(yù)后判斷提供新的思路及方法。
【圖文】：

圖 1：HSDL2 基因在 4 種人 MM 細(xì)胞株中 mRNA 表達(dá)豐度L2 基因 RNA 干擾慢病毒載體制備A 干擾靶點(diǎn)設(shè)計(jì)SDL2 基因?yàn)槟０澹O(shè)計(jì)多個(gè) 19-21nt RNA 干擾靶點(diǎn)序列。經(jīng)設(shè)

皖南醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文表 1 HSDL2 的 shRNA 干擾序基 STEM Loop CCAGAAGCAGTTAGCAAGAAATTCAAGAGATAAACCAGAAGCAGTTAGCAAGAAATCTCTTGAATA體線性化酶切反應(yīng)效率較高，1 2 3
【學(xué)位授予單位】：皖南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 郜亮;馮向先;;Toll樣受體4在惡性黑色素瘤中的表達(dá)及其介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的機(jī)制[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2015年06期

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本文編號(hào)：2680436