【摘要】：免疫系統(tǒng)在癌癥的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用,正常情況下免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別、控制甚至于消除腫瘤。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTLs)亦被稱為CD8~+T細(xì)胞或者殺傷性T細(xì)胞,是負(fù)責(zé)殺傷腫瘤細(xì)胞的主要免疫細(xì)胞。程序性細(xì)胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)表達(dá)于T細(xì)胞表面。當(dāng)PD-1與其配體(PD-1 ligand,PD-L1)相結(jié)合后,產(chǎn)生抑制信號(hào)從而抑制T細(xì)胞的活性。PD-L1可以表達(dá)于多種類型的細(xì)胞,PD-1/PD-L1通路在維持免疫系統(tǒng)自身耐受和生理免疫反應(yīng)的平衡中起著至關(guān)重要的作用。許多腫瘤細(xì)胞也表達(dá)PD-L1,腫瘤細(xì)胞可以利用PD-1途徑抑制T細(xì)胞活性,從而逃避CTLs對(duì)其識(shí)別同時(shí)避免CTLs對(duì)其殺傷,在這種情況下PD-1/PD-L1的檢查點(diǎn)功能阻斷了腫瘤的免疫周期,調(diào)節(jié)效應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)于腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)是PD-1的主要功能。據(jù)報(bào)道,PD-1水平的升高與腫瘤患者的T細(xì)胞耗竭或長(zhǎng)期刺激及生存不良有關(guān)。當(dāng)前,PD-1/PD-L1通路的阻斷是治療癌癥的一種有效治療方式,在肺癌患者和晚期惡性血液病患者的治療中都取得了顯著的進(jìn)步。在這項(xiàng)研究中,我們通過規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相關(guān)蛋白9(CRISPR-Associated protein 9,Cas9)系統(tǒng)在CTLs中編輯敲除了PD-1基因從而打斷了PD-1/PD-L1通路,然后我們研究了PD-1敲除(PD-1knockout,PD-1 KO)后效應(yīng)T細(xì)胞的抗腫瘤活性。第一部分構(gòu)建CRISPR/CAS9載體轉(zhuǎn)染T細(xì)胞刪除PD-1目的:應(yīng)用基因編輯技術(shù)crispr/cas9構(gòu)建有效載體轉(zhuǎn)染T細(xì)胞刪除其內(nèi)表達(dá)的PD-1。方法:設(shè)計(jì)非靶向引導(dǎo)RNA序列和3個(gè)PD-1引導(dǎo)RNA序列分別克隆到載體lenticrispr V2中,將293 T細(xì)胞與載體共培養(yǎng)生成慢病毒,慢病毒與T細(xì)胞共培養(yǎng)以轉(zhuǎn)染T細(xì)胞刪除PD-1基因,從而獲得PD-1 KO CTLs。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染T細(xì)胞效率,轉(zhuǎn)染后T細(xì)胞存活率,Western blot檢測(cè)PD-1蛋白在CTLs細(xì)胞的表達(dá)情況。結(jié)果:1.成功設(shè)計(jì)非靶向引導(dǎo)RNA序列和3個(gè)PD-1引導(dǎo)RNA序列,并克隆到載體lenticrispr V2中。2.成功獲得含有PD-1引導(dǎo)RNA序列的慢病毒,轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞后獲得PD-1敲除后的CTLs細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率約為28.5%。3.Western blot檢測(cè)PD-1敲除后的CTLs細(xì)胞中PD-1的表達(dá),結(jié)果顯示PD-1的總表達(dá)顯著降低,表明在轉(zhuǎn)導(dǎo)的CTLs中PD-1KO是有效的。第二部分PD-1刪除T細(xì)胞體外抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究目的:觀察研究PD-1 KO CTLs細(xì)胞在體外抗腫瘤的作用。方法:分別將實(shí)驗(yàn)組PD-1 KO CTLs,對(duì)照組CTLs與多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)細(xì)胞共培養(yǎng),檢測(cè)MM.1S細(xì)胞的活力。通過WST-1方法檢測(cè)兩組細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷活性。應(yīng)用AnnexinV/7-AAD染色MM.1S細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)分析腫瘤細(xì)胞凋亡,然后用不同的caspase底物孵育MM.1S細(xì)胞裂解液,檢測(cè)其caspase活性。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ的分泌量。結(jié)果:1.與對(duì)照組CTLs相比PD-1 KO CTLs抗腫瘤細(xì)胞毒作用增強(qiáng)。2.與對(duì)照組CTLs相比PD-1 KO CTLs誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡能力增強(qiáng)并增強(qiáng)caspase活性,caspase-3、caspase-8和caspase-9活性分別是對(duì)照組的8.21±0.47、6.58±0.41和4.92±0.35倍。3.ELISA檢測(cè)顯示PD-1 KO CTLs分泌的TNF-α和IFN-γ分別為對(duì)照組的2.43±0.18和1.92±0.21倍。第三部分PD-1刪除T細(xì)胞體內(nèi)抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究目的:研究觀察PD-1 KO CTLs細(xì)胞在MM移植瘤小鼠模型體內(nèi)的抗腫瘤作用。方法:通過鼠尾靜脈注射外周血單個(gè)核細(xì)胞的方法構(gòu)建人源化的NOD/SCID小鼠模型,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血中人CD3~+T淋巴細(xì)胞和CD19~+B淋巴細(xì)胞的表達(dá)情況。利用人源化NOD/SCID小鼠制造MM移植瘤動(dòng)物模型,成瘤后將動(dòng)物隨機(jī)分為2組進(jìn)行試驗(yàn),分別給予PD-1KO CTLs(實(shí)驗(yàn)組)、CTLs(對(duì)照組)細(xì)胞治療4次,每隔一天用卡尺測(cè)量腫瘤大小。計(jì)算各組移植瘤的平均體積和SD值。腫瘤體積達(dá)到2000mm~3時(shí)處死小鼠。用Kaplan-Meier法分析總生存期。結(jié)果:1.NOD/SCID小鼠人源化后其外周血中檢測(cè)到人CD3~+T淋巴細(xì)胞和CD19~+B淋巴細(xì)胞的表達(dá),且表達(dá)比例在正常成人水平,表明人源化成功。2.NOD/SCID小鼠MM移植腫瘤2周后可觀察到,并且PD-1KO CTLs治療組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)與CTLs治療組相比明顯受到抑制。3.CTLs治療組小鼠于52天內(nèi)全部死于進(jìn)展期移植腫瘤,相比之下PD-1KO CTLs治療組只有40%的小鼠同期死亡。結(jié)論:1.CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以有效地在CTLs之中敲除PD-1基因。2.PD-1基因敲除增強(qiáng)了CTLs對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡能力增強(qiáng)并增強(qiáng)caspase活性,可能是通過影響caspase蛋白相關(guān)通路的作用而促進(jìn)腫瘤凋亡,細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ的分泌量明顯升高。3.通過鼠尾靜脈注射外周血單個(gè)核細(xì)胞的方法成功構(gòu)建了人源化的NOD/SCID小鼠模型,并成功制造人MM移植瘤模型。PD-1KO CTLs細(xì)胞在體內(nèi)展現(xiàn)出良好的抗腫瘤作用,有效地抑制了人MM細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng),顯著提高了移植小鼠的整體存活率。
【圖文】：

圖 1 慢病毒 Cas9/gRNA 圖譜Fig.1 Lentivirus Cas9/gRNAmapA 第 1 天 B 第 3 天A 第 1 天 B 第 3 天

樹突狀細(xì)胞表型流式檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R730.51

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 蔣敬庭;;細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞抗腫瘤機(jī)制及應(yīng)用[J];臨床檢驗(yàn)雜志;2012年10期

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本文編號(hào)：2680143