【摘要】：免疫系統(tǒng)在癌癥的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用,正常情況下免疫系統(tǒng)能夠識別、控制甚至于消除腫瘤。細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTLs)亦被稱為CD8~+T細胞或者殺傷性T細胞,是負責殺傷腫瘤細胞的主要免疫細胞。程序性細胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)表達于T細胞表面。當PD-1與其配體(PD-1 ligand,PD-L1)相結(jié)合后,產(chǎn)生抑制信號從而抑制T細胞的活性。PD-L1可以表達于多種類型的細胞,PD-1/PD-L1通路在維持免疫系統(tǒng)自身耐受和生理免疫反應的平衡中起著至關(guān)重要的作用。許多腫瘤細胞也表達PD-L1,腫瘤細胞可以利用PD-1途徑抑制T細胞活性,從而逃避CTLs對其識別同時避免CTLs對其殺傷,在這種情況下PD-1/PD-L1的檢查點功能阻斷了腫瘤的免疫周期,調(diào)節(jié)效應性T細胞對于腫瘤細胞的反應是PD-1的主要功能。據(jù)報道,PD-1水平的升高與腫瘤患者的T細胞耗竭或長期刺激及生存不良有關(guān)。當前,PD-1/PD-L1通路的阻斷是治療癌癥的一種有效治療方式,在肺癌患者和晚期惡性血液病患者的治療中都取得了顯著的進步。在這項研究中,我們通過規(guī)律成簇間隔短回文重復序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相關(guān)蛋白9(CRISPR-Associated protein 9,Cas9)系統(tǒng)在CTLs中編輯敲除了PD-1基因從而打斷了PD-1/PD-L1通路,然后我們研究了PD-1敲除(PD-1knockout,PD-1 KO)后效應T細胞的抗腫瘤活性。第一部分構(gòu)建CRISPR/CAS9載體轉(zhuǎn)染T細胞刪除PD-1目的:應用基因編輯技術(shù)crispr/cas9構(gòu)建有效載體轉(zhuǎn)染T細胞刪除其內(nèi)表達的PD-1。方法:設(shè)計非靶向引導RNA序列和3個PD-1引導RNA序列分別克隆到載體lenticrispr V2中,將293 T細胞與載體共培養(yǎng)生成慢病毒,慢病毒與T細胞共培養(yǎng)以轉(zhuǎn)染T細胞刪除PD-1基因,從而獲得PD-1 KO CTLs。流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染T細胞效率,轉(zhuǎn)染后T細胞存活率,Western blot檢測PD-1蛋白在CTLs細胞的表達情況。結(jié)果:1.成功設(shè)計非靶向引導RNA序列和3個PD-1引導RNA序列,并克隆到載體lenticrispr V2中。2.成功獲得含有PD-1引導RNA序列的慢病毒,轉(zhuǎn)染T淋巴細胞后獲得PD-1敲除后的CTLs細胞,流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率約為28.5%。3.Western blot檢測PD-1敲除后的CTLs細胞中PD-1的表達,結(jié)果顯示PD-1的總表達顯著降低,表明在轉(zhuǎn)導的CTLs中PD-1KO是有效的。第二部分PD-1刪除T細胞體外抗腫瘤作用的實驗研究目的:觀察研究PD-1 KO CTLs細胞在體外抗腫瘤的作用。方法:分別將實驗組PD-1 KO CTLs,對照組CTLs與多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)細胞共培養(yǎng),檢測MM.1S細胞的活力。通過WST-1方法檢測兩組細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷活性。應用AnnexinV/7-AAD染色MM.1S細胞,流式細胞術(shù)分析腫瘤細胞凋亡,然后用不同的caspase底物孵育MM.1S細胞裂解液,檢測其caspase活性。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞因子TNF-α和IFN-γ的分泌量。結(jié)果:1.與對照組CTLs相比PD-1 KO CTLs抗腫瘤細胞毒作用增強。2.與對照組CTLs相比PD-1 KO CTLs誘導腫瘤細胞凋亡能力增強并增強caspase活性,caspase-3、caspase-8和caspase-9活性分別是對照組的8.21±0.47、6.58±0.41和4.92±0.35倍。3.ELISA檢測顯示PD-1 KO CTLs分泌的TNF-α和IFN-γ分別為對照組的2.43±0.18和1.92±0.21倍。第三部分PD-1刪除T細胞體內(nèi)抗腫瘤作用的實驗研究目的:研究觀察PD-1 KO CTLs細胞在MM移植瘤小鼠模型體內(nèi)的抗腫瘤作用。方法:通過鼠尾靜脈注射外周血單個核細胞的方法構(gòu)建人源化的NOD/SCID小鼠模型,流式細胞術(shù)檢測小鼠外周血中人CD3~+T淋巴細胞和CD19~+B淋巴細胞的表達情況。利用人源化NOD/SCID小鼠制造MM移植瘤動物模型,成瘤后將動物隨機分為2組進行試驗,分別給予PD-1KO CTLs(實驗組)、CTLs(對照組)細胞治療4次,每隔一天用卡尺測量腫瘤大小。計算各組移植瘤的平均體積和SD值。腫瘤體積達到2000mm~3時處死小鼠。用Kaplan-Meier法分析總生存期。結(jié)果:1.NOD/SCID小鼠人源化后其外周血中檢測到人CD3~+T淋巴細胞和CD19~+B淋巴細胞的表達,且表達比例在正常成人水平,表明人源化成功。2.NOD/SCID小鼠MM移植腫瘤2周后可觀察到,并且PD-1KO CTLs治療組小鼠的腫瘤生長與CTLs治療組相比明顯受到抑制。3.CTLs治療組小鼠于52天內(nèi)全部死于進展期移植腫瘤,相比之下PD-1KO CTLs治療組只有40%的小鼠同期死亡。結(jié)論:1.CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以有效地在CTLs之中敲除PD-1基因。2.PD-1基因敲除增強了CTLs對腫瘤細胞的細胞毒作用,誘導腫瘤細胞凋亡能力增強并增強caspase活性,可能是通過影響caspase蛋白相關(guān)通路的作用而促進腫瘤凋亡,細胞因子TNF-α和IFN-γ的分泌量明顯升高。3.通過鼠尾靜脈注射外周血單個核細胞的方法成功構(gòu)建了人源化的NOD/SCID小鼠模型,并成功制造人MM移植瘤模型。PD-1KO CTLs細胞在體內(nèi)展現(xiàn)出良好的抗腫瘤作用,有效地抑制了人MM細胞在體內(nèi)生長,顯著提高了移植小鼠的整體存活率。
【圖文】：

圖 1 慢病毒 Cas9/gRNA 圖譜Fig.1 Lentivirus Cas9/gRNAmapA 第 1 天 B 第 3 天A 第 1 天 B 第 3 天

樹突狀細胞表型流式檢測
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R730.51

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 蔣敬庭;;細胞因子誘導的殺傷細胞抗腫瘤機制及應用[J];臨床檢驗雜志;2012年10期

2 石永進;任漢云;岑溪南;朱強;虞積仁;;免疫效應細胞促進阿霉素誘導乳腺癌耐藥細胞凋亡[J];中華腫瘤雜志;2006年03期

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本文編號：2680143