發(fā)布時間：2020-05-24 22:43

【摘要】：研究背景白血病是血液系統(tǒng)惡性腫瘤,其發(fā)生的主要機制是由于造血細胞在某一分化階段出現了分化障礙,不能繼續(xù)終末分化,而保留其惡性增殖的能力。目前治療白血病的方法主要有造血干細胞移植及化療,但造血干細胞移植費用昂貴且受供者來源限制,化療副作用及微小殘留病灶使白血病易復發(fā)。因此尋找新的治療白血病的方法和藥物成為白血病領域亟待解決的問題。其中將白血病細胞向免疫細胞定向誘導分化是目前研究的熱點,擁有良好的應用前景。樹突狀細胞(DC)是體內功能最強大的抗原提呈細胞(APC),在抗腫瘤、抵抗病原微生物感染及維持機體內環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用。但發(fā)現白血病患者DC數量少、功能低以及伴有發(fā)育及成熟障礙,不能有效激發(fā)適應性免疫應答,殺傷白血病細胞。因此提高白血病患者體內樹突狀細胞(DC)的數量及功能將為治療白血病提供新的途徑。直接將白血病細胞誘導成DC為有效途徑,這種白血病來源的DC含白血病相關的特異性抗原,能夠直接把白血病抗原呈遞給T細胞,進而殺傷白血病細胞。目前,主要通過細胞因子將白血病細胞定向向DC誘導,但是由于其誘導機制不明確導致誘導DC效率不高、功能不穩(wěn)定,因此明確其誘導分化機制是提高誘導效率與功能的突破口。信號轉導與轉錄激活因子(STAT)家族成員在調控DC發(fā)育分化過程中發(fā)揮重要作用,研究發(fā)現細胞因子可以通過活化STAT3促進DC特異性核轉錄因子E2-2轉錄進而促進漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)發(fā)育分化,也可以通過STAT5促進DC特異性核轉錄因子ID2轉錄進而促進經典樹突狀細胞(cDC)的分化發(fā)育。目前,有關調控STAT誘導DC分化的研究主要圍繞正常人單核細胞誘導方面,但其在影響白血病細胞定向分化為DC中的作用尚不清楚。近年來,隨著人類基因組計劃的完成及表觀遺傳學發(fā)展,長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)對基因表達及生理功能的調控成為新興熱點。LncRNA是指長度大于200個核苷酸的RNA,本身不編碼蛋白質,但可通過轉錄后調控或翻譯后修飾等表觀遺傳調控作用影響其靶向物的表達或功能。近年來的研究發(fā)現LncRNA在體細胞的分化發(fā)育、腫瘤的惡性轉移中發(fā)揮重要作用。在DC細胞中同樣也表達大量的DC,但其在DC的發(fā)育分化中的作用知之甚少,因此此方向的深入探索有望成為靶向治療白血病的突破口。研究目的本研究以人急性單核白血病細胞THP-1為研究對象,利用粒細胞巨噬細胞—集落刺激因子(GM-CSF)聯(lián)合白細胞介素4(IL-4)誘導其向DC分化,用脂多糖(LPS)誘導THP-1來源DC成熟,探討THP-1向樹突狀細胞(DC)誘導分化機制,以期為白血病的治療提供新的靶點和途徑。實驗方法實驗將人急性單核白血病細胞THP-1隨機分為兩組,實驗組以粒細胞巨噬細胞-集落刺激因子(GM-CSF)聯(lián)合白細胞介素4(IL-4)誘導其向DC分化,脂多糖(LPS)誘導DC成熟,對照組培養(yǎng)于RPMI1640完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)第7天,收集兩組細胞,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài),流式細胞術檢測DC表面標志性分子CD11c及DC表面功能分子(共刺激分子CD80、CD86、組織相容性抗原HLA-DR、趨化因子CCR7表達,qPCR法檢測STAT5及ID2轉錄水平,Western blot檢測STAT5總蛋白及磷酸化水平。在此基礎上,本課題利用Agilent高通量基因芯片對白血病源DC分化過程中靶向ID2的LncRNA進行了初步的篩選,并通過qPCR法對其進行表達驗證和機制探討。實驗結果實驗結果顯示與對照組相比,THP-1細胞經細胞因子誘導后可見明顯的樹突狀突起,呈現DC形態(tài)學變化;流式細胞術檢測結果顯示THP-1細胞經細胞因子誘導后細胞表面DC標志性分子CD11c及功能分子(共刺激分子CD80、CD86、組織相容性抗原HLA-DR、趨化因子CCR7表達均出現明顯升高現象(P0.05);qPCR檢測結果顯示,THP-1細胞經細胞因子誘導后STAT5、DC特異性核轉錄因子ID2轉錄水平升高(P0.05);Western blot檢測STAT5總蛋白表達及磷酸化水平均出現明顯升高現象(P0.05)。我們對白血病源DC分化過程中靶向ID2 LncRNA篩選結果顯示LncRNA Lnc-CHCHD7-4-1出現明顯升高(P0.05),LncRNA ENST00000222753出現明顯降低(P0.05);相關性分析顯示LncRNA Lnc-CHCHD7-4-1與ID2表達呈顯著正相關(Pearson r=0.9944,P0.05),LncRNA ENST00000222753與ID2表達呈顯著負相關(Pearson r=-0.8830,P0.05)。實驗結論以上結果表明,THP-1細胞為白血病源DC敏感細胞株,在白血病源DC誘導分化過程中STAT信號通路發(fā)揮重要作用;STAT5通過調控ID2表達在白血病源DC誘導分化過程中發(fā)揮重要作用。同時,我們通過相關性分析發(fā)現LncRNALnc-CHCHD7-4-1與ID2呈顯著正相關,而LncRNA ENST00000222753與ID2呈顯著性負相關,提示LncRNA調控STAT5/ID2信號通路可能是白血病THP-1細胞向DC分化的關鍵機制之一,靶向調控LncRNA/STAT5信號通路可能成為白血病診斷、治療及預后評估的潛在有效新靶點與途徑。
【圖文】：

圖 1. STAT 信號通路簡介研究表明 STAT 家族在樹突狀細胞的分化發(fā)育中發(fā)揮非常關鍵的作用。樹突發(fā)育主要由細胞因子調控，在細胞因子的作用下 STAT 的酪氨酸被細胞因子 JAK 激酶磷酸化，STAT 酪氨酸磷酸化導致 STAT 與受體分離然后二聚化，

圖 2. 倒置顯微鏡觀察誘導前后細胞形態(tài)變化（×200）注: A 為對照組 THP-1 細胞形態(tài)；B 為細胞因子誘導后觀察組細胞形態(tài)。.1.2 THP-1 誘導前后 DC 表面特征性分子 CD11c 的表達
【學位授予單位】：濟南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R733.7

【參考文獻】

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本文編號：2679111