【摘要】：第一部分miR-146a-5p在食管鱗癌組織和患者血清中的表達(dá)情況及其臨床價(jià)值背景食管癌是全球致死率最高的消化道惡性腫瘤之一,我國(guó)95%以上食管癌患者的病理類型為食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell cancer,ESCC)。盡管食管癌的診療手段取得了很大的進(jìn)步,但多數(shù)患者確診時(shí)已為進(jìn)展期,食管癌患者的預(yù)后依然較差,五年生存率僅為15%-25%,因此早期診斷對(duì)改善患者預(yù)后有重要價(jià)值。預(yù)后評(píng)測(cè)指標(biāo)可以幫助明確食管癌患者預(yù)后的優(yōu)劣,篩選出預(yù)后較差的患者,指導(dǎo)臨床治療。然而,現(xiàn)有的食管癌診斷和預(yù)后指標(biāo)的敏感性和特異性較差,因此尋找高度敏感和特異的指標(biāo)迫在眉睫。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是小片段非編碼RNA,可以通過清除mRNA或阻礙mRNA翻譯過程進(jìn)而發(fā)揮對(duì)靶基因的抑制作用。越來越多的證據(jù)表明miRNAs可以發(fā)揮促癌或抑癌作用,參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等進(jìn)程。miR-146a-5p已經(jīng)在多種腫瘤中被研究報(bào)道,miR-146a-5p在乳腺癌、肺癌、胰腺癌和胃癌組織中為低表達(dá),上調(diào)miR-146a-5p表達(dá)水平可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,這與黑色素瘤、宮頸鱗癌和甲狀腺癌中miR-146a-5p高表達(dá)水平正好相反,這一現(xiàn)象提示miR-146a-5p在不同腫瘤生長(zhǎng)中的調(diào)控機(jī)制具有多樣性。然而,miR-146a-5p在食管鱗癌中的表達(dá)水平及臨床價(jià)值尚未報(bào)道,本研究旨在檢測(cè)miR-146a-5p在ESCC組織和患者血清中的表達(dá)水平,探討miR-146a-5p在ESCC預(yù)后和診斷中的價(jià)值。方法我們采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction,qPCR)技術(shù)檢測(cè)了 62對(duì)ESCC腫瘤組織和癌旁組織、115例福爾馬林固定石蠟包埋組織以及154例ESCC患者和154例正常人血清中miR-146a-5p的表達(dá)水平,并采用Kaplan-Meier曲線、Cox回歸模型以及受試者工作特征(receiver-operating characteristic,ROC)曲線分析其預(yù)后和診斷價(jià)值。結(jié)果與癌旁正常組織相比,ESCC組織中miR-146a-5p的表達(dá)水平明顯下降(0.50±0.36 vs 1.06±0.09,P0.001),并且miR-146a-5p的表達(dá)水平與食管癌患者的T分期(P=0.037)和TNM分期(P=0.004)呈負(fù)相關(guān)。Kaplan-Meier曲線和log-rank檢驗(yàn)結(jié)果提示miR-146a-5p的低表達(dá)水平預(yù)示著較差的總生存率(overall survival,OS)(P = 0.017)和無進(jìn)展生存率(Progression-free survival,PFS)(P = 0.004),多因素分析提示miR-146a-5p是ESCC患者OS(P=0.022)和PFS(P=0.004)的獨(dú)立預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)。食管鱗癌患者血清miR-146a-5p的水平比正常人的低(發(fā)現(xiàn)組:0.69±0.41 vs 1.79±0.85,P0.001;驗(yàn)證組:0.57±0.29 vs 1.49±0.56,P0.001),在發(fā)現(xiàn)組中ROC曲線下面積(Area under the curve of ROC,AUC)、敏感性和特異性分別為0.863±0.033、85.7%和68.6%,在驗(yàn)證組中分別為0.891±0.027、82.1%和83.3%。結(jié)論miR-146a-5p在ESCC腫瘤組織和患者血清中均明顯下調(diào),組織miR-146a-5p的表達(dá)水平可以作為ESCC的獨(dú)立預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo);血清miR-146a-5p作為ESCC的診斷指標(biāo),具有較高的敏感性和特異性。第二部分Notch2在食管鱗癌組織中的表達(dá)及其預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值背景靶向治療是腫瘤治療領(lǐng)域的重大突破,靶向藥物特異地結(jié)合并殺死腫瘤細(xì)胞,降低了對(duì)正常組織的副作用。食管癌靶向治療的臨床研究正在大量開展,然而目前的機(jī)制研究和臨床實(shí)驗(yàn)效果不甚理想,針對(duì)已有靶點(diǎn)探索新的靶向藥物或發(fā)掘新的食管癌治療靶點(diǎn)有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。Notch信號(hào)通路在胚胎生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖和凋亡、干性維持和分化等過程中發(fā)揮了重要作用,在食管癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌和宮頸癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也扮演了重要角色。研究發(fā)現(xiàn),Notch1高表達(dá)水平與食管腺癌的分化、分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),通過γ-分泌酶抑制劑(Gamma-secretase inhibitor,GSI)抑制Notch活性可以增強(qiáng)食管腺癌的化療敏感性。Notch2在肺癌、膠質(zhì)瘤、宮頸癌、肝癌、胃癌等腫瘤組織中呈高表達(dá)趨勢(shì),可以發(fā)揮促癌作用,然而在膀胱癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌等腫瘤中表達(dá)下調(diào),發(fā)揮抑癌作用,這一現(xiàn)象提示Notch2在腫瘤中的調(diào)控機(jī)制具有多樣性。全基因組和外顯子測(cè)序分析揭示了食管癌組織中Notch信號(hào)分子存在突變,包括Notch2基因的突變,然而Notch2蛋白在ESCC組織的表達(dá)水平和臨床價(jià)值尚未見報(bào)道,本研究擬探討ESCC組織中Notch2蛋白的表達(dá)水平及其預(yù)后價(jià)值,并揭示Notch2在ESCC細(xì)胞增殖和生存中的作用,為ESCC提供新的臨床治療策略。方法我們采用 qPCR、免疫組化(Immunohistochemical staining,IHC)和 western blot等方法,探討ESCC組織中Notch2 mRNA和蛋白的表達(dá)情況,采用log-rank檢驗(yàn)和多因素生存分析評(píng)價(jià)其預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值,并采用CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)探討敲除Notch2是否可以抑制ESCC細(xì)胞的增殖和克隆形成能力。結(jié)果與癌旁正常組織相比,ESCC腫瘤組織Notch2的mRNA和蛋白水平均明顯上調(diào)(qPCR:P0.0001;IHC:P = 0.004;WB:P=0.021)。Log-rank 檢驗(yàn)提示 Notch2的高表達(dá)水平與ESCC患者較差的OS和PFS密切相關(guān)(OS:29.1%vs.49.1%,P=0.013;PFS:15.3%vs.34.4%,P = 0.006),多因素分析提示Notch2 可以作為ESCC 患者 OS(HR(95%CI):2.266(1.367-3.756),P = 0.002)和 PFS(HR(95%CI):2.160(1.374-3.396),P = 0.006)的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,與對(duì)照組相比,shRNA-Notch2組細(xì)胞的48h和72h的OD450值明顯降低;抑制Notch2表達(dá)后,ESCC細(xì)胞克隆形成率也顯著下降(所有P0.0001)。結(jié)論ESCC組織中的Notch2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào),Notch2蛋白高表達(dá)水平提示患者預(yù)后較差,可以作為預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)。下調(diào)Notch2的表達(dá)水平可抑制ESCC細(xì)胞的增殖和克隆形成能力,提示Notch2在ESCC細(xì)胞增殖中發(fā)揮了重要作用,該研究可為ESCC臨床治療提供新的靶點(diǎn)。第三部分miR-146a-5p靶向Notch2調(diào)控食管鱗癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化背景腫瘤轉(zhuǎn)移是食管癌患者治療失敗的主要原因,探索食管癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制、發(fā)掘新的治療靶點(diǎn)對(duì)于改善治療效果有重要價(jià)值。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在腫瘤轉(zhuǎn)移中扮演了重要角色,發(fā)生 EMT 的腫瘤細(xì)胞失去了上皮細(xì)胞極性,出現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞的特征,細(xì)胞游動(dòng)和遷移能力增加,促進(jìn)了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。miRNAs是小片段非編碼RNA分子,通過靶向結(jié)合和清除mRNA或抑制蛋白翻譯過程進(jìn)而抑制靶基因的表達(dá)。研究表明,miRNAs在腫瘤EMT進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用,比如,miR-630通過靶向作用于Wnt/betacatenin通路抑制胃癌EMT,miR-514a-3p則通過靶向EGFR抑制腎透明細(xì)胞癌的EMT進(jìn)程。miR-146a-5p在腫瘤EMT調(diào)控中也有重要作用,miR-146a-5p可以通過抑制胰島素受體底物2抑制非小細(xì)胞肺癌的EMT進(jìn)程;發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織較原發(fā)組織的miR-146a-5p的表達(dá)量明顯降低,提示miR-146a-5p與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)miR-146a-5p在ESCC組織和患者血清中低表達(dá),可以作為較好的預(yù)后和診斷指標(biāo)。Notch信號(hào)通路在EMT進(jìn)程也發(fā)揮了重要作用,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT發(fā)生后,可檢測(cè)到Notch2表達(dá)水平增高;相應(yīng)的,抑制Notch2的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)EMT進(jìn)程,下調(diào)Vimentin、E盒結(jié)合鋅指蛋白 1(Zinc Finger E-box binding homeobox-boxl,ZEB1)、Slug 和 Snail 等間質(zhì)性蛋白的表達(dá),并降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。我們的前期研究表明,Notch2在ESCC組織高表達(dá),可以作為患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo),體外實(shí)驗(yàn)揭示了 Notch2的促癌作用,干擾Notch2蛋白表達(dá)可以抑制ESCC細(xì)胞的增殖和克隆形成能力,然而Notch2在ESCCEMT進(jìn)程中的調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步探索。靶基因預(yù)測(cè)系統(tǒng)提示,miR-146a-5p可以結(jié)合Notch2的3'-UTR區(qū)域,據(jù)此,本研究繼續(xù)探討miR-146a-5p和Notch2參與ESCC侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制,或可為ESCC的臨床治療提供新的策略。方法我們采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、qPCR和western blot等實(shí)驗(yàn)方法分別探討miR-146a-5p和Notch2在EMT進(jìn)程中的作用,靶基因預(yù)測(cè)系統(tǒng)和雙熒光素酶報(bào)告用于驗(yàn)證miR-146a-5p對(duì)Notch2的靶向調(diào)控作用。結(jié)果miR-146a-5p mimics轉(zhuǎn)染后穿過Transwell小室的ESCC細(xì)胞數(shù)量明顯下降(EC9706:86.00±3.74vs 198.33±5.44,P0.001;Eca109:73.33±2.87vs 153.00±5.72,P0.001),miR-146a-5p inhibitor 轉(zhuǎn)染組穿過 Transwell 小室的 ESCC 細(xì)胞數(shù)量明顯增多(EC9706:417.00±12.83 vs 198.33±5.44,P0.001;Eca109:358.67±10.66vs 153.00±5.72,P0.001)。在 miR-146a-5pmimics 組中,E-cadherin 的表達(dá)上調(diào)(EC 9706:P=0.002;Eca109:P=0.001),而 Snail(EC9706:P=0.004;Eca109:P=0.001)和 Vimentin(EC9706:P=0.003;Eca109:P=0.001)蛋白表達(dá)水平明顯下降。相應(yīng)的,miR-146a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染組中,可檢測(cè)到E-cadherin表達(dá)水平下降(EC 9706:P = 0.007;Eca109:P0.001),而 Snail(EC 9706:P=0.005;Eca109:P=0.017)和 Vimentin(EC 9706:P0.001;Eca 109:P0.001)蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)。miRNA靶基因預(yù)測(cè)系統(tǒng)提示Notch2的3'UTR區(qū)存在miR-146a-5p的結(jié)合位點(diǎn),雙熒光素酶報(bào)告表明,miR-146a-5p mimics抑制野生型Notch2 3'-UTR轉(zhuǎn)染組的熒光值(EC9706:0.49±0.07 vs 1.04±0.12,P= 0.003;Eca109:0.51±0.02 vs 1.01±0.02,P0.001),miR-146a-5p inhibitor 可上調(diào)野生型 Notch2 3'-UTR 轉(zhuǎn)染組的熒光值(EC9706:1.63±0.09vs 1.04±0.12,P = 0.002;Eca109:1.51±0.02 vs 1.01±0.02,P0.001),而對(duì) Notch2 3'-UTR 突變組沒有影響(所有 P0.05)。shRNA-Notch2轉(zhuǎn)染可以抑制 Tranwell 侵襲細(xì)胞數(shù)量(EC9706:66.33±5.31 vs 153.00±9.20,P0.001;Eca109:55.33±7.85vs166.00±10.42,P0.001),使 Snail 和 Vimentin(所有P0.001)蛋白表達(dá)水平下降,E-cadherin蛋白表達(dá)水平上調(diào)(EC 9706:P0.001;Eca109:P=0.002)。更重要的是,shRNA-Notch2 可以削弱 miR-146a-5pinhibitor對(duì)ESCC細(xì)胞侵襲能力和EMT進(jìn)程的促進(jìn)作用(anti-miR-146a-5p+anti-Notch2組vs anti-miR-146a-5p+Notch2-NC 組:EC 9706:Transwell,179.33±7.76 vs 404.00±12.57,P0.001;Snail,P0.001;Vimentin,P0.001;E-cadherin,P=0.002;Eca109:Transwell,111.33±9.84 vs 249.67±15.92,P0.001;Snail,P0.001;Vimentin,P=0.002;E-cadherin,P=0.003)。結(jié)論miR-146a-5p可以靶向抑制Notch2表達(dá),進(jìn)而抑制ESCC的EMT進(jìn)程,發(fā)揮抑癌基因的作用,為食管癌的治療開辟了新的策略。
【圖文】：

圖１邋ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ在食管淲癌腫瘤組織和癌旁組織中的表達(dá)差異。結(jié)果提示ＥＳ腫瘤組織中的表達(dá)水平低于癌旁正常組織（０．５０±０．３６邋ｖｓ邋１．０６±０．０９，邋ＰＯ．ＯＯｌ）。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑１丨邐一＿．邐Ｐ邋＝０．０１７邐１0＂邋邐Ｐ－ａ＼Ｎ邐＼Ｖ逡逑ｏ－Ｂ－邐＼逡逑＂５邐４邋Ｈｉｇｈ邋？ｐｒｅｓｓｉｏｎＩ？ｖｅｌ邋ｏｆ邋ｍｉＲ－１４６ｔｔ－５ｔ邐＇ｉＳ邐Ｘ逡逑ｉ０６－邐ｓ＝．邋Ｓ．，逡逑Ｃ邐Ｌ邐Ｌ－，邐Ｊ＿邐Ｓ．邐一ＵＨｉｄｉ邋ｅｍｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅＥ邐？邋Ｌｏｗ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋ｍｉＲ－１４６ａ－５ｊ邐ｇ邐＊＊，邐＊—ｉ逡逑Ｓ０Ａ￣邐ｖ邐３０４＇邐＼邐＾邐＊＾Ｌｏｗ邋ｅ＾ｊｗｓｓｉｏｎ邋ｌｅ０２－邐0＿２￣邐＾＊￣Ｌ逡逑？—０．０■邐0＿0■逡逑0．00邐２０．００邐４０．００邐６０．００邐８０．００邐0．00邐２0加邐４０．００邐６０．００Ｏｖｅｒａｌｌ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ邋（ｍｏｎｔｈｓ）邐Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ－ｆｒｅｅ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ邋（ｍｏｎｔｈ

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本文編號(hào)：2679051