【摘要】：研究目的:在全球范圍內(nèi),乳腺癌是女性人群中高發(fā)的癌癥之一,其嚴(yán)重的危害著女性的健康,國(guó)際癌癥研究所所發(fā)布的2012年全球癌癥相關(guān)數(shù)據(jù)顯示:在統(tǒng)計(jì)的所有癌癥當(dāng)中,女性乳腺癌的發(fā)病人數(shù)及死亡人數(shù)均為最高。乳腺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移是乳腺癌重要的惡性生物學(xué)行為特征,也是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要因素。上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換稱為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,簡(jiǎn)稱EMT。在此過程中,細(xì)胞表達(dá)的粘附分子發(fā)生改變,使細(xì)胞傾向于發(fā)生轉(zhuǎn)移及侵襲。在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程中一個(gè)顯著的特征就是腫瘤及侵襲抑制因子E-cadherin的下調(diào),進(jìn)而使得細(xì)胞之間的緊密連接減少,腫瘤細(xì)胞更容易侵襲到遠(yuǎn)端組織與器官,與此同時(shí)間質(zhì)基因N-cadherin及fibronectin明顯上調(diào),更利于細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤組織自身血管網(wǎng)絡(luò)的發(fā)展,惡性、生長(zhǎng)活躍的腫瘤大多有明顯的腫瘤血管生成。血管生成擬態(tài)簡(jiǎn)稱VM,能使腫瘤細(xì)胞獲得營(yíng)養(yǎng)及生長(zhǎng)因子以支持后續(xù)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及利于腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移通常提示預(yù)后不佳,早期診斷并在轉(zhuǎn)移前獲得有效治療的乳腺癌患者生存率高。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)及血管生成擬態(tài)(Vasculogenic mimicry,VM)是影響乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié),因此有效抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及血管生成擬態(tài)的發(fā)生對(duì)于預(yù)防乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及對(duì)提高患者生存率和改善預(yù)后具有重要意義。SND1蛋白作為一種多功能蛋白在多種腫瘤中高表達(dá),SND1的異常升高與腫瘤患者的預(yù)后生存率密切相關(guān)。盡管SND1與乳腺癌進(jìn)程的相關(guān)性已經(jīng)基本明確,但是在乳腺癌中高水平的SND1對(duì)乳腺癌進(jìn)展作用的具體分子機(jī)制還有很多空白有待補(bǔ)充。因此本實(shí)驗(yàn)的目的是探討SND1如何調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及血管生成擬態(tài)進(jìn)而影響乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。研究方法1.利用慢病毒體系在MDA-MB-231細(xì)胞中構(gòu)建穩(wěn)定敲低SND1蛋白的細(xì)胞株,并用Western-Blot、q-PCR檢測(cè)敲低效率。2.在野生型及敲低SND1的細(xì)胞株中利用體外的生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)(包括MTT、transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、血管生成擬態(tài)實(shí)驗(yàn))檢測(cè)細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及血管擬態(tài)生成擬態(tài)能力的變化。3.利用Western-Blot、q-PCR的方法檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的marker分子在m RNA及蛋白水平的變化。4.用5-aza處理細(xì)胞檢測(cè)E-cadherin蛋白的表達(dá)情況;用Me DIP和BSP的方法檢測(cè)E-cadherin啟動(dòng)子甲基化的變化。5.利用Western-Blot、q-PCR的方法檢測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在m RNA及蛋白水平的變化。6.利用Ch IP及蟲螢光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SND1對(duì)DNMT3A的轉(zhuǎn)錄調(diào)控;利用Ch IP檢測(cè)DNMT3A結(jié)合到E-cadherin啟動(dòng)子的變化。研究結(jié)果1.在MDA-MB-231細(xì)胞中成功構(gòu)建了穩(wěn)定敲低SND1蛋白的細(xì)胞株MDA-MB-231-SND1-sh,SND1在蛋白及m RNA水平都明顯降低。2.敲低SND1的細(xì)胞株相對(duì)于野生型細(xì)胞株來說其增殖、侵襲、遷移、血管擬態(tài)形成能力明顯減弱。3.敲低SND1的細(xì)胞株相對(duì)于野生型細(xì)胞株來說上皮表型的marker分子E-cadherin在蛋白及m RNA水平都明顯升高,間質(zhì)表型的marker蛋白N-cadherin在蛋白水平明顯下調(diào)。4.MDA-MB-231細(xì)胞株用5-aza處理后E-cadherin重新表達(dá);敲低SND1的細(xì)胞株相對(duì)于野生型細(xì)胞株E-cadherin啟動(dòng)子甲基化明顯減少。5.敲低SND1的細(xì)胞株相對(duì)于野生型細(xì)胞株來說DNMT3B及DNMT1在蛋白水平?jīng)]有明顯變化,而DNMT3A在蛋白水平及m RNA水平都明顯降低。6.SND1通過轉(zhuǎn)錄激活DNMT3A的表達(dá)進(jìn)一步影響E-cadherin啟動(dòng)子甲基化。研究結(jié)論:在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞中,SND1通過轉(zhuǎn)錄激活DNMT3A的表達(dá)進(jìn)一步使E-cadherin啟動(dòng)子高甲基化而抑制其表達(dá),使細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及血管生成擬態(tài)的能力增強(qiáng),進(jìn)一步促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。
【圖文】：

圖 1 血管生成擬態(tài)調(diào)節(jié)的分子機(jī)制（四）SND1 蛋白與腫瘤SND1（Staphylococcal nuclease domain containing 1）蛋白，又稱 Tudor-SN或 p100，是一種進(jìn)化上非常保存，在真核生物體中廣泛表達(dá)的多功能蛋白。SND1是一個(gè)分子量達(dá) 100kD 的蛋白，由 5 個(gè)不同結(jié)構(gòu)域組成，包括 N 端的 4 個(gè)連續(xù)的 SN 結(jié)構(gòu)域及 C 端的 Tudor 結(jié)構(gòu)域，它具有輔助激活因子和 RNA 剪切體的雙重功能，可以同時(shí)通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控功能基因的表達(dá)。在細(xì)胞核內(nèi)SND1 利用 N 端的 SN 結(jié)構(gòu)域以募集轉(zhuǎn)錄復(fù)合體及促進(jìn)組蛋白乙酰化的方式直接促進(jìn)目的基因的轉(zhuǎn)錄，行使輔助轉(zhuǎn)錄激活因子功能[58]。在細(xì)胞核外 SND1 通過其 C 端的 TSN 結(jié)構(gòu)域結(jié)合小分子核糖核蛋白（snRNP），參與 RISC 復(fù)合物的形成，介導(dǎo) Let7-miRNA 引發(fā)的基因沉默[59]。近年的研究結(jié)果表明 SND1 是一個(gè)非常有潛力的腫瘤分子標(biāo)志：Sarkar,D等報(bào)道SND1在AEG-1協(xié)同下通過激活RISC功能促進(jìn)肝細(xì)胞癌生長(zhǎng)[60,61]，Egawa,S 通過蛋白組學(xué)方法鑒定 SND1 是前列腺癌的新潛在分子指標(biāo)[62]，Nakagama,H 等發(fā)現(xiàn) SND1 在結(jié)腸癌中的表達(dá)水平比正常

28圖 1.1MeDIP 實(shí)驗(yàn)原理NA(方法如前所述)ug 的蛋白酶 K 處理過的基因組 DNA 溶于 1m聲，功率為 45%，超聲 30s 停 30s，15 個(gè)循糖膠，取 200ng的超聲過的 DNA跑膠驗(yàn)證超300 500 bp。NA 分成三份，Input 組 1ug，IP 組和 IgG 組各水中，99 煮沸 10min 使 DNA 變性。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.9

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳萬(wàn)青;鄭榮壽;;中國(guó)女性乳腺癌發(fā)病死亡和生存狀況[J];中國(guó)腫瘤臨床;2015年13期

，

本文編號(hào)：2679316