【摘要】：目的乳腺癌是世界范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤之一。隨著對乳腺癌認(rèn)識的不斷深入,以雌激素受體(estrogen receptor,ER),孕激素受體(progesterone receptor,PR)和人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)為代表的重要生物標(biāo)記物被發(fā)現(xiàn)。這些生物標(biāo)記物幫助臨床醫(yī)生對乳腺癌患者的預(yù)后做出更準(zhǔn)確的判斷,此外一些以此為靶點(diǎn)的治療手段(例如內(nèi)分泌治療和抗HRE2靶向治療)也逐漸問世,有效的延長了乳腺癌患者的生存時間。但仍然有部分患者無法從現(xiàn)存的靶向治療中獲益,而且隨著耐藥性的產(chǎn)生,亟需尋找更為有效的乳腺癌治療靶點(diǎn)。作為人體內(nèi)蛋白質(zhì)主要的降解途徑,蛋白酶體途徑異常可以通過增強(qiáng)癌蛋白穩(wěn)定性或者促進(jìn)抑癌蛋白的降解參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。探索泛素-蛋白酶體途徑,尋找新腫瘤治療靶點(diǎn)正逐漸成為熱點(diǎn)。組成型光形態(tài)建成蛋白9(constitutive photomorphogenesis 9,COP9)信號復(fù)合體(CSN)六號亞單位(CSN6)可以作為一個泛素化修飾的調(diào)節(jié)因子參與細(xì)胞周期調(diào)控,DNA損傷修復(fù)等生物過程。E3泛素連接酶決定了蛋白酶體途徑降解底物蛋白的特異性。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)CSN6可以廣泛作用于各種類型的E3泛素連接酶,通過調(diào)節(jié)其活性影響腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)的泛素修飾及降解,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。CSN6在乳腺癌中發(fā)揮的作用還缺乏直接而系統(tǒng)的證據(jù)。本研究探討CSN6與乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性,探討CSN6對乳腺癌細(xì)胞生長,遷移及侵襲的影響,并構(gòu)建CSN6在乳腺癌中信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),為明確乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供依據(jù)。材料與方法一、驗證CSN6在乳腺癌中的表達(dá)1、免疫組織化學(xué)染色法驗證本院手術(shù)乳腺癌患者標(biāo)本CSN6蛋白水平表達(dá);2、Oncomine和Kaplan-Meier plotter公共數(shù)據(jù)平臺驗證數(shù)據(jù)庫中包含的乳腺癌患者CSN6 m RNA水平表達(dá)。二、CSN6表達(dá)與臨床病理學(xué)特征和預(yù)后的關(guān)系1、采用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件卡方檢驗分析CSN6蛋白與乳腺癌患者臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系,Kaplan-Meier法和Cox比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行生存分析;2、Oncomine公共數(shù)據(jù)平臺驗證CSN6 m RNA與乳腺癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系;3、Kaplan-Meier plotter公共數(shù)據(jù)平臺驗證CSN6 m RNA與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。三、使用慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定敲減CSN6基因的乳腺癌細(xì)胞系MCF7,T47D和MDA-MB-2311、采用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及慢病毒轉(zhuǎn)染效率;2、Western blot確定敲減效率。四、驗證CSN6對乳腺癌細(xì)胞生長和侵襲轉(zhuǎn)移的影響1、MTS實(shí)驗觀察CSN6對乳腺癌細(xì)胞MCF7,T47D和MDA-MB-231活力的影響;2、克隆形成實(shí)驗觀察CSN6對乳腺癌細(xì)胞MCF7和MDA-MB-231增殖的影響;3、Transwell實(shí)驗檢測CSN6對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。五、乳腺癌中CSN6信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的生物信息學(xué)分析1、乳腺癌GEO數(shù)據(jù)集GSE25066的下載,數(shù)據(jù)處理及差異表達(dá)基因分析;2、使用GO分析和KEGG分析尋找CSN6相關(guān)差異表達(dá)基因富集的生物學(xué)過程和信號通路;3、皮爾森相關(guān)系數(shù)計算CSN6與其他基因的相關(guān)性,篩選出共表達(dá)基因集,繪制共表達(dá)基因與CSN6的關(guān)系圖。使用String數(shù)據(jù)庫對共表達(dá)基因集進(jìn)行分析,制作CSN6相關(guān)的共表達(dá)互作網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果1、CSN6與乳腺癌高危臨床病理學(xué)特征相關(guān)。CSN6蛋白的高表達(dá)與腫物大小(P=0.041),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.01)和腫瘤的TNM分期(P=0.002)呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。乳腺癌轉(zhuǎn)移灶中CSN6 m RNA的表達(dá)顯著高于原發(fā)灶(差異倍數(shù)值=2.154,差異顯著性P值=0.022)。在分子亞型方面,HER2陽性型乳腺癌有CSN6蛋白高表達(dá)的趨勢(85.7%),雖然結(jié)果不具備統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.052)。2、CSN6與乳腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。CSN6 m RNA的高表達(dá)與乳腺癌患者無復(fù)發(fā)生存時間(風(fēng)險比=1.19,95%可信區(qū)間:1.07-1.33,log-rank P值=0.0015),無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存時間(風(fēng)險比=1.26,95%可信區(qū)間:1.02-1.54,log-rank P值=0.028)呈負(fù)相關(guān)。CSN6蛋白高表達(dá)與乳腺癌患者無病生存時間(log-rank P值=0.028)和總生存時間(log-rank P值=0.038)呈負(fù)相關(guān),而且是影響無病生存時間的獨(dú)立預(yù)后因素(風(fēng)險比=3.83,95%可信區(qū)間:1.14-12.79,P值=0.029)。進(jìn)一步探索CSN6對不同分子亞型乳腺癌預(yù)后的影響,CSN6 m RNA高表達(dá)在四種分子分型的乳腺癌患者中都與無復(fù)發(fā)生存時間呈負(fù)相關(guān),但在Luminal B型(風(fēng)險比=1.53,95%可信區(qū)間:1.25-1.88,log-rank P值=2.9e-05)和Basal like型(風(fēng)險比=1.48,95%可信區(qū)間:1.15-1.91,log-rank P值=0.0023)的乳腺癌患者中更為明顯,具有統(tǒng)計學(xué)差異。3、敲減CSN6抑制乳腺癌細(xì)胞的活力和增殖。MTS實(shí)驗檢測敲減CSN6前后不同時間點(diǎn)乳腺癌細(xì)胞MCF7,T47D和MDA-MB-231活力。結(jié)果顯示,培養(yǎng)120小時后,MCF7/KD的細(xì)胞增殖率為209.22±9.76%,MCF7/NC-KD細(xì)胞增殖率為306.85±35.36%(P=0.014)。T47D/KD細(xì)胞增殖率為284.43±1.65%%,T47D/NC-KD細(xì)胞增殖率為356.59±14.22%(P=0.012)。MDA-MB-231/KD細(xì)胞增殖率為310.30±11.76%,MDA-MB-231/NC-KD細(xì)胞增殖率為348.52±19.25%(P=0.043)�？寺⌒纬蓪�(shí)驗顯示,培養(yǎng)14天后,MCF7/KD的細(xì)胞集落數(shù)量為66.67±13.65個,MCF7/NC-KD細(xì)胞集落數(shù)量為115±15.72(P=0.016);MDA-MB-231/KD的細(xì)胞集落數(shù)量為141±40.04,MDA-MB-231/NC-KD細(xì)胞集落數(shù)量為374.67±28.31(P=0.001)。4、敲減CSN6抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。通過Transwell遷移實(shí)驗發(fā)現(xiàn),孵育24小時后,未鋪基質(zhì)膠的Transwell實(shí)驗組MDA-MB-231/KD的細(xì)胞遷移數(shù)量為26.89±4.33,MDA-MB-231/NC-KD的細(xì)胞遷移數(shù)量為49.44±6.30(P=0.007);鋪基質(zhì)膠的Transwell實(shí)驗組MDA-MB-231/KD的細(xì)胞遷移數(shù)量為16.89±8.76,MDA-MB-231/NC-KD的細(xì)胞遷移數(shù)量為41.22±7.41(P=0.021)。5、乳腺癌中CSN6可能參與腫瘤免疫應(yīng)答和細(xì)胞粘附的過程。GO分析生物過程富集結(jié)果中,與免疫應(yīng)答(immune response,positive regulation of immune system process)和細(xì)胞粘附(cell adhesion,extracellular structure organization)描述相關(guān)的生物過程多次出現(xiàn)。在KEGG通路富集分析中可以觀察到與此類似的現(xiàn)象(Th1 and Th2 cell differentiation;Cell adhesion molecules,ECM-receptor interaction,Focal adhesion)。6、乳腺癌CSN6共表達(dá)基因的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系及蛋白調(diào)控互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的建立。我們發(fā)現(xiàn)CSN6基因與ILF2基因的共表達(dá)基因集有較高的重合率,而且二者的在多個Oncomine數(shù)據(jù)集中都存在正相關(guān)趨勢。結(jié)論1、CSN6高表達(dá)與乳腺癌腫瘤大小,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。2、CSN6高表達(dá)與乳腺癌患者不良生存相關(guān),而且CSN6蛋白高表達(dá)可以作為乳腺癌患者無病生存時間的獨(dú)立不良預(yù)后因素。3、CSN6 m RNA高表達(dá)對Luminal B型和Basal like型乳腺癌患者生存的影響更為明顯。4、敲減CSN6抑制乳腺癌細(xì)胞MCF7,T47D和MDA-MB-231的增殖活力。5、敲減CSN6抑制乳腺癌細(xì)胞MCF7和MDA-MB-231克隆形成能力。6、敲減CSN6抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的侵襲和遷移。7、CSN6相關(guān)差異表達(dá)基因富集在細(xì)胞粘附過程中,提示CSN6在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮比較顯著的促進(jìn)作用。8、CSN6相關(guān)差異表達(dá)基因富集在免疫調(diào)節(jié)激活過程中,提示CSN6可能參與乳腺癌腫瘤免疫應(yīng)答。9、某些腫瘤相關(guān)基因E2F1,HRAS,Caspase 9,WBSCR22作為節(jié)點(diǎn),在乳腺癌CSN6共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮比較重要的調(diào)控作用。10、ILF2可能參與了CSN6促進(jìn)乳腺癌發(fā)展的過程。
【圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3 實(shí)驗結(jié)果3.1 CSN6 與乳腺癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系3.1.1 CSN6 mRNA 表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系在Oncomine公共數(shù)據(jù)平臺中輸入篩選標(biāo)準(zhǔn)（P-VALUE<0.05，F(xiàn)OLDCHANGE>1.5，，GENE RANK TOP 10%）之后，CSN6在各個腫瘤中的表達(dá)狀態(tài)如圖1所示。

圖2 Oncomine公共數(shù)據(jù)平臺分析CSN6在乳腺癌組織中的表達(dá)A. CSN6表達(dá)與N分期的關(guān)系（Weigelt乳腺數(shù)據(jù)集），B. CSN6表達(dá)與M分期的關(guān)系（Bittner乳腺數(shù)據(jù)集），C. CSN6在原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)情況（Weigelt乳腺數(shù)據(jù)集）3.1.2 CSN6 蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系搜集到本院214例乳腺癌患者基本臨床信息如表1所示。入組患者年齡25~88歲，中位年齡51歲。表1 免疫組化染色納入患者的基本信息Number % Number %Age(year)mean(SD) 51.67 (10.74) ER statusmedian(range) 51 (25-88) Negative 72 33.6<50 101 47.2 Positive 132 61.7
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9

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本文編號：2678240