發(fā)布時(shí)間：2020-05-24 03:54

【摘要】：食管癌在全球常見(jiàn)惡性腫瘤中排名第八位,是全球第六大癌癥相關(guān)死亡原因,在中國(guó)發(fā)病率和死亡率均較高。鱗狀細(xì)胞癌(SCC)和腺癌(AC)是食管癌的兩種主要組織學(xué)類(lèi)型。在發(fā)達(dá)國(guó)家,食管腺癌約占食管癌患者的三分之二,而在發(fā)展中國(guó)家食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)占食管癌病例的90%。ESCC是中國(guó)主要的食管癌類(lèi)型。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)不斷進(jìn)步,但ESCC患者的總體死亡率仍然居高不下。ESCC具有家族遺傳性的特點(diǎn),在一些地區(qū)具有較高的發(fā)病率,特別是在中國(guó)北方的山西、河南與河北省接壤的地區(qū)。雖然已經(jīng)確定一些腫瘤抑制因子和癌基因在ESCC發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用,然而,ESCC發(fā)生和發(fā)展的確切分子機(jī)制尚未闡明。人PTPN6基因位于染色體12p13上,編碼相對(duì)分子量為68,000的非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶。PTPN6基因被認(rèn)為是血液和實(shí)體惡性腫瘤中的候選腫瘤抑制因子,且啟動(dòng)子區(qū)高甲基化可能是導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。然而,PTPN6的表達(dá)及其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)在ESCC發(fā)病機(jī)制中的詳細(xì)作用尚未完全闡明�；谝陨涎芯勘尘�,在本研究中,我們檢測(cè)了PTPN6在ESCC組織和食管癌細(xì)胞中的表達(dá),并分析其與患者臨床病理資料及預(yù)后之間的關(guān)系。進(jìn)一步檢測(cè)了CpG島高甲基化在PTPN6失活中的作用,旨在闡明PTPN6在ESCC發(fā)生和發(fā)展中的功能作用和預(yù)后意義。并通過(guò)體外過(guò)表達(dá)PTPN6基因,研究其對(duì)食管癌細(xì)胞體外增殖、遷移、侵襲能力的影響,進(jìn)一步深入探討PTPN6基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響作用。主要研究分為以下三個(gè)部分。第一部分PTPN6在ESCC中的表達(dá)及其臨床意義目的:檢測(cè)不同食管癌細(xì)胞系、71例ESCC組織及相應(yīng)癌旁正常組織中PTPN6的mRNA和蛋白表達(dá)水平,并分析其與ESCC惡性表型之間的關(guān)系,分析PTPN6蛋白表達(dá)與ESCC患者預(yù)后的關(guān)系。方法:1.研究對(duì)象人食管癌細(xì)胞系TE1、TE13、Eca109、Kyse150、Kyse170、Yes-2由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生物標(biāo)本庫(kù)保留并傳代,以人食管上皮細(xì)胞(HEEpiC)作為對(duì)照;組織來(lái)源于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科2008年至2011年收治的原發(fā)性食管癌患者71例。每例組織均取癌組織原發(fā)灶及距癌旁邊緣大于5cm處的癌旁正常組織作為正常對(duì)照。2.利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)的方法和Western blot方法分別檢測(cè)不同食管癌細(xì)胞系和對(duì)照組中PTPN6 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。3.分別應(yīng)用qRT-PCR和免疫組織化學(xué)方法分別檢測(cè)ESCC和癌旁正常組織中PTPN6 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。4.進(jìn)行Kaplan-Meier生存曲線分析。按ESCC組織中PTPN6的蛋白表達(dá)情況分為PTPN6陽(yáng)性表達(dá)組和陰性表達(dá)組。根據(jù)ESCC患者臨床生存期資料分析PTPN6表達(dá)與ESCC患者總生存期的關(guān)系。結(jié)果:1.食管癌細(xì)胞系中PTPN6的mRNA及蛋白的表達(dá)情況PTPN6 mRNA在六株食管癌細(xì)胞中的表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組,并且在Eca109和Yes-2細(xì)胞中表達(dá)低于其它四株細(xì)胞。PTPN6蛋白在六株食管癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于對(duì)照組,并且在Eca109和Yes-2細(xì)胞中表達(dá)低于其它四株細(xì)胞。2.ESCC患者癌及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本中PTPN6的mRNA及蛋白表達(dá)情況qRT-PCR的方法檢測(cè)ESCC及相應(yīng)癌旁正常組織中PTPN6的mRNA表達(dá)情況,結(jié)果顯示,71例ESCC組織中PTPN6 mRNA的表達(dá)量顯著低于相應(yīng)癌旁正常組織(1.000±0.001 vs 1.815±0.386,t=13.533,P0.05)。應(yīng)用免疫組化的方法檢測(cè)71例ESCC及相應(yīng)癌旁正常組織中PTPN6的蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,PTPN6蛋白在ESCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于相應(yīng)癌旁正常組織[32.4%(23/71)vs77.55(55/71),χ~2=29.128,P0.05]。ESCC組織中PTPN6的mRNA和蛋白表達(dá)與患者的TNM分期、腫瘤病理分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.05),而與年齡、性別、浸潤(rùn)深度及上消化道腫瘤家族史無(wú)關(guān)(P0.05)。1.PTPN6蛋白表達(dá)與ESCC患者臨床預(yù)后的關(guān)系PTPN6蛋白表達(dá)與ESCC患者的生存期有關(guān)。在PTPN6蛋白陽(yáng)性表達(dá)的ESCC患者中,5年生存率為39.1%,而PTPN6蛋白陰性表達(dá)組中5年生存率僅為18.4%(χ~2=3.391,P0.05,Log-rank test)。小結(jié):1.PTPN6的mRNA和蛋白在食管癌細(xì)胞系和ESCC組織中表達(dá)顯著降低,且其mRNA和蛋白表達(dá)均與患者的臨床病理特征有關(guān),提示PTPN6基因可能與ESCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的惡性表型相關(guān)。2.PTPN6的蛋白表達(dá)與ESCC患者的生存期顯著相關(guān),提示PTPN6可能作為判斷ESCC患者預(yù)后的一個(gè)分子指標(biāo)。第二部分ESCC中PTPN6第二啟動(dòng)子區(qū)P2甲基化狀態(tài)檢測(cè)及其與預(yù)后的關(guān)系目的:觀察甲基化抑制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-dC)藥物處理前后PTPN6的mRNA和蛋白表達(dá)水平的改變,應(yīng)用亞硫酸氫鹽-基因組測(cè)序法(Bisulfite Genomie Sequencing,BGS)檢測(cè)5-Aza-dC處理前后細(xì)胞PTPN6基因P2啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化頻率的分布情況,并根據(jù)甲基化CpG位點(diǎn)的分布情況設(shè)計(jì)引物,應(yīng)用甲基化特異性PCR(Methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)的方法檢測(cè)PTPN6在ESCC中的甲基化狀態(tài),并進(jìn)一步驗(yàn)證PTPN6表達(dá)下調(diào)與甲基化的關(guān)系。方法:1.細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理選取三株P(guān)TPN6表達(dá)較低的食管癌細(xì)胞系常規(guī)培養(yǎng),分別用濃度為5μmol/L的DNA甲基化酶抑制劑5-Aza-dC對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行處理,培養(yǎng)48小時(shí),期間每24小時(shí)更換培養(yǎng)液一次,處理完畢后以完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)收集細(xì)胞,用以后續(xù)的DNA、RNA及蛋白提取。2.利用qRT-PCR和Western blot的方法檢測(cè)5-Aza-dC處理前后不同食管癌細(xì)胞系中PTPN6 mRNA和蛋白表達(dá)情況。3.利用亞硫酸氫鹽基因組測(cè)序(bisulfite genomic sequencing,BGS)的方法檢測(cè)3株不同食管癌細(xì)胞系5-Aza-dC處理前后PTPN6 P2啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)的甲基化情況。4.利用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(Methylation-Specific Polymerase Chain Reaction,MSP)的方法檢測(cè)不同食管癌細(xì)胞系和ESCC及相應(yīng)癌旁正常組織中PTPN6基因的甲基化狀態(tài)。5.Kaplan-Meier生存曲線分析ESCC組織中PTPN6 P2啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性組和甲基化陰性組與ESCC患者總生存期的關(guān)系。結(jié)果:1.5-Aza-dC處理前后PTPN6 mRNA及蛋白的表達(dá)情況應(yīng)用qRT-PCR方法檢測(cè)5-Aza-dC處理食管癌細(xì)胞Eca109、Kyse170、Yes-2后PTPN6的mRNA表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)PTPN6表達(dá)明顯上調(diào)。且Western blot的方法檢測(cè)結(jié)果顯示,其蛋白表達(dá)也明顯上調(diào)。2.PTPN6 P2啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率檢測(cè)利用BGS的方法對(duì)-167bp到-326 bp的CpG位點(diǎn)進(jìn)行了測(cè)序,結(jié)果顯示,5-Aza-dC處理前食管癌細(xì)胞系中CpG位點(diǎn)的甲基化頻率均高于相應(yīng)處理后的食管癌細(xì)胞。3.5-Aza-dC處理前后PTPN6在不同食管癌細(xì)胞系中的甲基化狀態(tài)應(yīng)用5-Aza-dC處理前Eca109、Kyse170、Yes-2三株食管癌細(xì)胞均呈高甲基化狀態(tài),5-Aza-dC處理后Eca109和Yes-2細(xì)胞中PTPN6的甲基化程度均降低,表現(xiàn)為非甲基化狀態(tài)。5-Aza-dC處理后PTPN6在Kyse170細(xì)胞中有非甲基化條帶擴(kuò)出。4.ESCC及相應(yīng)癌旁正常組織中PTPN6 P2啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的檢測(cè)PTPN6 P2啟動(dòng)子區(qū)在ESCC組織中的甲基化率為63.4%(45/71),顯著高于相應(yīng)癌旁正常組織(16.9%,12/71)(P0.05)。并與ESCC患者的TNM分期、腫瘤病理分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.05)。在PTPN6甲基化陰性組,其mRNA表達(dá)量顯著高于PTPN6甲基化陽(yáng)性組的mRNA表達(dá)量(P0.05)。在PTPN6甲基化陰性組,其蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為65.4%(17/26),顯著高于PTPN6甲基化陽(yáng)性組的蛋白表達(dá)陽(yáng)性率(13.3%,6/45),(χ~2=20.386,P0.05)。5.PTPN6 P2啟動(dòng)子區(qū)甲基化與ESCC患者臨床預(yù)后的關(guān)系PTPN6 P2啟動(dòng)子區(qū)甲基化與ESCC患者的生存期有關(guān)。在PTPN6 P2啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化的ESCC患者中,5年生存率僅為15.2%,而該基因P2啟動(dòng)子區(qū)甲基化陰性組中5年生存率為42.3%(χ~2=5.383,P0.05,Log-rank test)。小結(jié):1.PTPN6 P2啟動(dòng)子區(qū)高甲基化可能是導(dǎo)致該基因表達(dá)下調(diào)的重要機(jī)制之一。2.PTPN6 P2啟動(dòng)子區(qū)甲基化可能作為食管鱗癌的預(yù)后因素,有望成為判斷ESCC患者臨床預(yù)后的檢測(cè)指標(biāo)之一。第三部分PTPN6對(duì)體外培養(yǎng)食管癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響目的:構(gòu)建PTPN6過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.1-PTPN6,分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Eca109和Yes-2細(xì)胞,觀察過(guò)表達(dá)PTPN6基因后對(duì)食管癌細(xì)胞體外增殖、遷移、侵襲的影響。方法:1.選取PTPN6相對(duì)表達(dá)最低的Eca109、Yes-2兩株食管癌細(xì)胞系,應(yīng)用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)載體pcDNA3.1-PTPN6和pcDNA3.1的方法分別轉(zhuǎn)染Eca109和Yes-2細(xì)胞,并利用qRT-PCR的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。2.MTS和克隆形成實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)過(guò)表達(dá)PTPN6后對(duì)食管癌細(xì)胞增殖能力的影響。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分別接種于96孔板,測(cè)定各孔的吸光度值;將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分別接種于6孔板,常規(guī)培養(yǎng)一周,結(jié)晶紫染色,并計(jì)算菌落數(shù),檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。3.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)PTPN6后對(duì)食管癌細(xì)胞遷移能力的影響。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分別接種于6孔板,培養(yǎng)24h后,用20μl移液器吸頭垂直于孔底劃一條直線,于顯微鏡下觀察并測(cè)量細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)遷移距離。4.應(yīng)用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)PTPN6后對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲能力的影響。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分別接種于加好Matrigel膠的上室中,常規(guī)培養(yǎng)24h后,染色固定,制成載玻片,顯微鏡下觀察各組穿膜細(xì)胞數(shù)判斷細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果:1.轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.1-PTPN6后轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)在第一研究部分中,我們發(fā)現(xiàn)PTPN6在食管癌細(xì)胞系Eca109和Yes-2中表達(dá)最低。因此選取這兩株細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。應(yīng)用qRT-PCR的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Eca109和Yes-2細(xì)胞PTPN6的表達(dá)量。結(jié)果顯示,與Eca109細(xì)胞和轉(zhuǎn)染了空載體的對(duì)照組相比,pcDNA3.1-PTPN6組的mRNA表達(dá)明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與Yes-2細(xì)胞和轉(zhuǎn)染了空載體的對(duì)照組相比,pcDNA3.1-PTPN6組的mRNA表達(dá)明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。經(jīng)檢測(cè)在兩株細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均高,可以進(jìn)行后續(xù)功能試驗(yàn)。2.過(guò)表達(dá)PTPN6后對(duì)Eca109和Yes-2食管癌細(xì)胞系增殖能力的影響利用MTS和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)PTPN6對(duì)食管癌細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)PTPN6基因后導(dǎo)致Eca109和Yes-2細(xì)胞的增殖能力明顯下降(P0.05)。3.過(guò)表達(dá)PTPN6基因后對(duì)Eca109和Yes-2食管癌細(xì)胞系遷移能力的影響采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)食管癌細(xì)胞的遷移能力,結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)PTPN6基因后食管癌細(xì)胞Eca109和Yes-2的遷移能力明顯降低(P0.05)。4.過(guò)表達(dá)PTPN6后對(duì)食管癌細(xì)胞Eca109和Yes-2侵襲能力的影響利用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)食管癌細(xì)胞的侵襲能力,結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)PTPN6能夠抑制Eca109和Yes-2細(xì)胞的侵襲能力(P0.05)。小結(jié):PTPN6過(guò)表達(dá)后抑制食管癌細(xì)胞體外增殖、遷移及侵襲的能力,可能在食管癌的惡性進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。結(jié)論:1.PTPN6在食管癌細(xì)胞系及ESCC組織中表達(dá)下調(diào)與食管癌的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān),且其P2啟動(dòng)子區(qū)高甲基化可能是導(dǎo)致該基因表達(dá)下調(diào)的重要機(jī)制之一。2.PTPN6蛋白表達(dá)及P2啟動(dòng)子區(qū)甲基化可作為ESCC患者獨(dú)立的預(yù)后因素,有望成為ESCC患者預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)之一。3.PTPN6過(guò)表達(dá)后可能會(huì)抑制食管癌細(xì)胞體外增殖、遷移及侵襲的能力。
【圖文】：

29A, C: tumor tissues; B, D: corresponding normal tissues.圖 1-1 2 對(duì) ESCC 組織及相應(yīng)癌旁正常組織的 HE 染色（200×）Fig.1-1 Hematoxylin-eosin staining in 2 matched pairs (case1 -case2esophageal squamous cancer and corresponding normal tissues (200×

30圖 1-2 不同細(xì)胞系中 PTPN6 基因的 mRNA 表達(dá)ig. 1-2 The mRNA expression of PTPN6 in different cell li
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R735.1

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9 何松,韓枋,吉志固,吳麗華;食管癌細(xì)胞學(xué)分級(jí)的可行性探討[J];腫瘤研究與臨床;1997年02期

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