【摘要】：癌癥是一類嚴重危害人類健康的重大疾病。肺癌的發(fā)病率和死亡率是所有癌癥中最高的。雖然我們在肺癌的預防、診斷和治療等方面已經取得很大的進步,但目前肺癌患者的預后仍然不樂觀,5年存活率為僅4-17%,所以急需深入研究其發(fā)生發(fā)展的機制,制定有效的治療方案。越來越多的研究顯示,腫瘤由多種亞群細胞構成。其中有一部分細胞具有類似于干細胞的自我更新能力和多向分化潛能,稱之為腫瘤干細胞(cancer stem cell,CSC)。CSC可以進行不對稱分裂,不僅可以分裂出保留CSC生物學特性的子代細胞,而且可以分化出實體瘤所包含的其它類型的腫瘤細胞,從而驅動腫瘤的形成并促進腫瘤的發(fā)展。CSC同樣被認為是轉移瘤的起始細胞。隨著腫瘤不斷生長,不同的亞群細胞生存競爭越來越激烈,生存壓力驅動腫瘤細胞進化。具備細胞分化能力的CSC有更大的進化優(yōu)勢,經歷上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)等過程的CSC獲得更強的遷移侵襲能力,從腫瘤原發(fā)部位轉移到其它器官組織。自我更新和多向分化潛能使CSC分化出能適應新環(huán)境的子代細胞,最終形成轉移瘤。化療抵抗是肺癌治療面臨的一個重大難題。CSC是導致化療抵抗的重要因素。CSC可以通過增強膜轉運蛋白活性和激活抗凋亡通路等方式抵抗化療。常規(guī)化療藥物殺死大多數腫瘤細胞,存活的CSC通過自我更新和分化導致癌癥的復發(fā)。CSC對腫瘤的發(fā)生、轉移、化療抵抗、復發(fā)都起重要作用,通過作用于調控CSC的信號通路抑制CSC成為治療肺癌的新策略。叉頭框(fork head box,FOX)蛋白是一類具有一段高度保守翼狀環(huán)DNA結合域的轉錄因子。FOXA1、FOXM1、FOXQ1等多個FOX家族成員被證實是調控CSC的重要轉錄因子。Forkhead box C1(FOXC1)是FOX蛋白家族成員之一,在多種癌癥中證實有促癌的作用。最近有研究表明FOXC1與細胞干性密切相關。FOXC1對毛囊干細胞、造血干細胞的干性有重要調控作用。Hedgehog和Notch是調控CSC的重要信號通路。FOXC1不僅可以通過直接調節(jié)內皮細胞中的Dll4來激活Notch信號通路,而且可以通過直接結合Gli2來增強Hedgehog信號通路活性,所以FOXC1很可能與CSC密切相關。使用UALCANC分析TCGA數據庫,我們發(fā)現在非小細胞肺癌(NSCLC)的癌組織中FOXC1的表達水平顯著增高,但目前沒有文獻報道FOXC1在NSCLC中對CSC的調控作用,因此本研究探究FOXC1是否對NSCLC腫瘤干細胞樣特性有影響。第一部分FOXC1在NSCLC中表達以及對生存期的影響目的:探究FOXC1在NSCLC中表達以及對生存期的影響。方法:使用UALCANC在線分析TCGA數據庫中NSCLC患者的癌組織和肺正常組織中FOXC1的表達差異。使用The Human Protein Atlas在線分析TCGA數據庫中NSCLC患者的癌組織中FOXC1表達量和生存期的關系。結果:FOXC1在肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)和肺鱗狀細胞癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)癌組織中的表達顯著高于肺正常組織(P0.01,P0.01)。與低表達FOXC1的LUAD和LUSC的患者相比,高表達FOXC1的LUAD和LUSC患者的存活率更低(P0.05,P0.05)。結論:1.FOXC1在NSCLC癌組織中的表達異常增高,FOXC1可能是影響NSCLC發(fā)生的重要因素。2.FOXC1表達與NSCLC患者的存活率呈負相關,FOXC1可能是影響NSCLC患者預后的重要因素。第二部分FOXC1對NSCLC腫瘤干細胞樣特性的影響目的:探究FOXC1對NSCLC腫瘤干細胞樣特性的影響。方法:1.使用慢病毒構建FOXC1低表達和高表達穩(wěn)轉細胞株。2.實時熒光定量PCR檢測基因的m RNA水平。3.Western Blot檢測基因的蛋白水平。4.流式細胞術檢測CD133+細胞比例。5.干細胞球形成實驗檢測腫瘤干細胞的自我更新能力。6.裸鼠移植瘤實驗檢測NSCLC細胞的致瘤能力。7.使用Transwell檢測NSCLC細胞的遷移和侵襲能力。8.采用CCK-8檢測細胞活力。9.采用流式細胞術檢測凋亡細胞比例。結果:1.FOXC1增強NSCLC腫瘤細胞干性:(1)FOXC1表達降低抑制NSCLC腫瘤細胞干性。1)與對照細胞A549-LV-sh Control相比,FOXC1低表達穩(wěn)轉細胞A549-LV-sh FOXC1的FOXC1 m RNA和蛋白水平顯著降低(P0.01,P0.01)。2)FOXC1表達減少顯著降低CD133+細胞的比例(P0.01),3)減少干細胞球數目(P0.01),4)降低腫瘤干細胞功能標志物SOX2、Oct4、NANOG、ABCG2的m RNA水平(P0.01,P0.01,P0.01,P0.01)和蛋白水平(P0.01,P0.01,P0.01,P0.01)。(2)FOXC1表達升高增強NSCLC腫瘤細胞干性。1)與對照細胞NCI-H1299-LV-Control相比,FOXC1高表達穩(wěn)轉細胞NCI-H1299-LV-FOXC1的FOXC1 m RNA和蛋白水平顯著增高(P0.01,P0.01)。2)FOXC1表達增高顯著增加CD133+細胞的比例(P0.05),3)增多干細胞球數目(P0.01),4)增高腫瘤干細胞功能標志物SOX2、Oct4、NANOG、ABCG2的m RNA水平(P0.05,P0.01,P0.05,P0.01)和蛋白水平(P0.01,P0.05,P0.01,P0.01)。2.FOXC1增強NSCLC細胞的致瘤能力:(1)FOXC1表達降低抑制NSCLC細胞的致瘤能力。1)FOXC1低表達穩(wěn)轉細胞A549-LV-sh FOXC1 5×103、5×104、5×105組裸鼠皮下移植瘤實驗的成瘤率(1/8、6/8、7/8)低于對照細胞A549-LV-sh Control的成瘤率(4/8、7/8、8/8)。2)A549-LV-sh FOXC1細胞組的腫瘤體積小于對照細胞A549-LV-sh Control的腫瘤體積。3)A549-LV-sh FOXC1細胞5×105組的腫瘤重量明顯減輕(P0.01),A549-LV-sh FOXC1細胞5×103和5×104組的腫瘤重量平均值小于A549-LV-sh Control細胞5×103和5×104組的腫瘤重量平均值,但在統(tǒng)計學上無顯著性差異(P0.05,P0.05)。(2)FOXC1表達升高增強NSCLC細胞的致瘤能力。1)FOXC1高表達穩(wěn)轉細胞NCI-H1299-LV-FOXC1裸鼠皮下移植瘤實驗的成瘤率(3/8、6/8、8/8)高于對照細胞NCI-H1299-LV-Control的成瘤率(1/8,4/8、7/8)。2)NCI-H1299-LV-FOXC1細胞組的腫瘤體積大于NCI-H1299-LV-Control細胞組的腫瘤體積。3)NCI-H1299-LV-FOXC1細胞5×104組的腫瘤重量明顯大于NCI-H1299-LV-Control 5×104組腫瘤重量(P0.01),NCI-H1299-LV-FOXC1細胞5×103和5×105組的腫瘤重量平均值大于NCI-H1299-LV-Control細胞5×103和5×105組的腫瘤重量平均值,但在統(tǒng)計學上無顯著性差異(P0.05,P0.05)。3.FOXC1增強NSCLC細胞的遷移侵襲能力:(1)FOXC1表達降低抑制NSCLC細胞的遷移侵襲。1)FOXC1表達降低不僅顯著抑制A549細胞的遷移(P0.01),2)而且抑制A549細胞的侵襲(P0.01)。3)FOXC1表達降低顯著減少了間質標志物Vimentin、fibronectin、N-cadherin的蛋白表達(P0.01,P0.05,P0.01),對上皮標志物E-Cadherin蛋白表達無顯著影響(P0.05)。(2)FOXC1表達升高促進NSCLC細胞的遷移侵襲。1)FOXC1表達增高不僅顯著促進NCI-H1299細胞遷移(P0.01),2)而且促進NCI-H1299細胞的侵襲(P0.01)。3)FOXC1表達增高顯著增加了間質標志物Vimentin、fibronectin、N-cadherin的蛋白表達(P0.05,P0.01,P0.05),NCI-H1299細胞細胞中未檢測到上皮標志物E-Cadherin的蛋白表達。4.FOXC1誘導NSCLC細胞產生化療抵抗:(1)FOXC1表達降低增加NSCLC細胞的化療敏感性。1)FOXC1表達降低顯著增強順鉑和多烯紫杉醇對A549細胞活力的抑制作用,2)增加順鉑和多烯紫杉醇導致的凋亡細胞的比例(P0.01,P0.01),3)增高凋亡蛋白cleaved caspase-3和促凋亡蛋白BIM的蛋白水平(P0.01,P0.05)。(2)FOXC1表達升高降低NSCLC細胞的化療敏感性。1)FOXC1表達升高顯著減弱順鉑和多烯紫杉醇對NCI-H1299細胞活力的抑制作用,2)顯著減小順鉑和多烯紫杉醇導致的凋亡細胞的比例(P0.01,P0.05),3)降低cleaved caspase-3和BIM的蛋白水平(P0.01,P0.01)。結論:FOXC1增強NSCLC腫瘤干細胞樣特性,包括增強NSCLC細胞干性、致瘤能力和遷移侵襲能力以及誘導化療抵抗。第三部分FOXC1增強NSCLC腫瘤干細胞樣特性的分子機制研究目的:探究FOXC1增強NSCLC腫瘤干細胞樣特性的分子機制。方法:(1)熒光定量PCR檢測基因的m RNA表達水平。(2)Western Blot檢測基因的蛋白表達水平。(3)免疫組化檢測基因在瘤組織中的蛋白水平。(4)雙熒光素酶報告基因實驗檢測FOXC1對beta-catenin啟動子活性的調控作用。(5)染色質免疫共沉淀(Ch IP)檢測FOXC1與beta-catenin啟動子的結合位點。(6)使用慢病毒構建beta-catenin低表達和高表達穩(wěn)轉細胞株。(7)流式細胞術檢測CD133+細胞比例。(8)干細胞球形成實驗檢測腫瘤干細胞的自我更新能力。(9)使用Transwell檢測NSCLC細胞的遷移和侵襲能力。(10)采用CCK-8檢測細胞活力。結果:1.FOXC1增強beta-catenin啟動子活性促進beta-catenin表達:(1)FOXC1表達減少顯著降低A549細胞beta-catenin m RNA水平、總蛋白和細胞核蛋白水平(P0.01,P0.01,P0.01)。(2)免疫組化結果顯示FOXC1表達的降低減少了beta-catenin在移植瘤中的表達。(3)FOXC1表達增加顯著增高NCI-H1299細胞beta-catenin m RNA水平、總蛋白和細胞核蛋白水平(P0.01,P0.05,P0.01)。(4)FOXC1表達的增高顯著增加beta-catenin在移植瘤中的表達。(5)雙熒光素酶報告基因實驗顯示FOXC1可以增強beta-catenin啟動子活性(P0.01)。(6)在TRANSFAC和JASPARJ數據庫分析beta-catenin啟動子序列,發(fā)現beta-catenin啟動子中存在三個FOXC1可能的結合位點:BS1,GTTCGTTTGTT(-1268/-1258)beta-catenin;BS2,TCTATAAACAT(-997/-987)beta-catenin;BS3,TTATTTGTTCA(-821/-811)beta-catenin.。BS1和BS3的突變沒有顯著影響FOXC1對beta-catenin啟動子的激活作用(P0.05,P0.05),BS2的突變顯著減弱了FOXC1對beta-catenin啟動子的激活作用(P0.01)。(7)Ch IP-PCR結果進一步確認BS2是FOXC1在beta-catenin啟動子上的結合位點。2.Beta-catenin介導FOXC1對NSCLC腫瘤干細胞的特性的調控作用:(1)Beta-catenin表達升高逆轉FOXC1表達降低對NSCLC腫瘤干細胞樣特性的抑制作用。1)與對照細胞相比,A549-sh FOXC1-LV-beta-catenin細胞beta-catenin的總蛋白和核蛋白水平顯著升高(P0.01,P0.05)。2)Beta-catenin表達升高逆轉FOXC1表達降低對NSCLC細胞干性的抑制作用,使CD133+細胞的比例顯著增高(P0.01),干細胞球數目顯著增多(P0.01),SOX2、Oct4、NANOG、ABCG2的蛋白水平顯著增高(P0.05,P0.05,P0.01,P0.01)。3)Beta-catenin表達升高逆轉FOXC1表達降低對NSCLC細胞遷移侵襲的抑制作用。與對照細胞A549-sh FOXC1-LV-Control相比,Beta-catenin表達增高促進A549-sh FOXC1-LV-beta-catenin細胞的遷移和侵襲(P0.01,P0.05)。4)Beta-catenin表達升高逆轉FOXC1表達降低引起的化療增敏作用。與對照細胞A549-sh FOXC1-LV-Control相比,beta-catenin表達增高顯著減弱了順鉑和多烯紫杉醇對A549-sh FOXC1-beta-catenin細胞活力的抑制作用。(2)Beta-catenin表達降低逆轉FOXC1表達升高對NSCLC腫瘤干細胞樣特性的增強作用。1)與對照細胞相比,NCI-H1299-FOXC1-LV-shbeta-catenin細胞beta-catenin的總蛋白和核蛋白水平顯著降低(P0.01,P0.05)。2)Beta-catenin表達降低逆轉FOXC1表達升高對NSCLC細胞干性的增強作用,使CD133+細胞的比例顯著降低(P0.01),干細胞球數目顯著減少(P0.01),SOX2、Oct4、NANOG、ABCG2的蛋白水平顯著降低(P0.01,P0.01,P0.01,P0.01)。3)Beta-catenin表達降低逆轉FOXC1表達增高對NSCLC細胞遷移侵襲的增強作用。與對照細胞NCI-H1299-FOXC1-LV-sh Control相比,beta-catenin表達降低顯著抑制NCI-H1299-FOXC1-LV-shbeta-catenin細胞的遷移和侵襲(P0.01,P0.05)。4)Beta-catenin表達降低逆轉FOXC1表達增高引起的化療抵抗。Beta-catenin表達降低增強了順鉑、多烯紫杉醇對NCI-H1299-FOXC1-LV-shbeta-catenin細胞活力的抑制作用。結論:FOXC1通過增強beta-catenin啟動子活性促進beta-catenin表達來增強NSCLC腫瘤干細胞樣特性。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2

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本文編號：2676670