【摘要】：TF在凝血過程中發(fā)揮著至關重要的作用,能與血漿凝血因子Ⅶ/Ⅶa(FⅦ/Ⅶa)特異性結合,形成的TF-FⅦa復合物可以激活FⅨ和FⅩ,激活的FX(FXa)和共因子(FVa)可以水解凝血酶原,最終導致凝血酶形成,引發(fā)血液凝固。越來越多的研究表明,很多實體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的瘤細胞均高表達TF,因為腫痛血管內皮細胞本身的不完整和內皮細胞間連接的不緊密,導致血管具有一定的可透過性和TF的滲漏,從而使腫瘤血管的內皮細胞表面高表達TF。這些TF既與腫瘤血管新生及轉移相關,也與腫瘤患者的血栓性靜脈炎關系密切,這在臨床上被稱為Trousseau's綜合癥。而對于正常組織血管而言,TF分布在血管外層等血液循環(huán)之外的區(qū)域,只有當血管損傷或內皮破損時血液才有機會和這些表達TF的細胞接觸,從而啟動上述凝血過程。所以,選擇TF作為靶向腫^茄苣諂は赴陌械憔哂辛己玫奶匾煨�。本课题组前浦J芯康腅GFP-EGF1蛋白具有TF特異性和高度的親和力,且將其連接于聚乙二醇-聚乳酸-聚羥基乙酸納米粒(PLGA)納米粒表面后構建的EGFP-EGF1-PLGA納米粒也具有TF靶向性。 光化學反應能夠使血管內皮細胞受損,引發(fā)血小板聚集,從而形成血栓。其發(fā)生機制為：特定波長的光照射使血管內皮細胞膜上的光敏劑受到激發(fā),此激發(fā)狀態(tài)下的光敏劑可以把能量傳遞給周圍的氧,生成高活性的單態(tài)氧,單態(tài)氧和細胞膜、細胞核、細胞質等中的重要生物大分子(如蛋白質、脂質和核酸等)發(fā)生氧化反應,從而啟動脂質過氧化反應,損傷血管內皮細胞,從而引起TF的釋放激活凝血瀑布,造成局部的血栓形成。在該光化學反應過程中,光敏劑作為能量的載體和反應的橋梁,發(fā)揮著關鍵性的作用。血卟啉單甲醚(hematoporphyrin monomethyl ethe, HMME),是種成分單一、性能穩(wěn)定的新型光敏劑,其激發(fā)峰為395nm,發(fā)射峰為613nm。它能夠從體內迅速清除,毒性明顯低于第一代光敏劑(血卟啉衍生物)。由于血卟啉單甲醚體內注射后很快就被肝臟的枯否(Kupffer)細胞吞噬,其血液中的濃度會迅速下降,如果想造成肝臟以外的,身體其他目標部位的梗塞,必須提高初始的給藥劑量。全身m藥濃度過高除造成肝臟損害外,還需要避光來防止日光照射產生活性氧對身體淺表部位的傷害。那么采用靶向給藥的方式可大大降低全身給藥劑量,既能在目標部位形成較高濃度,又可以盡量減少正常部位藥物濃度,從而將藥物對正常組織的損傷降至最低。 由此,研究者設想：能否將血卟啉單甲醚包載在EGF1-EGFP-NP內部,通過納米粒的TF靶向性運載到高表達TF的腫瘤血管,然后針對瘤體采用冷光源照射,局部產生活性氧損傷血管內皮可引起TF進一步釋放,這樣既給TF靶向納米粒提供更多的靶標募集更多的納米粒,也可通過這種瀑布效應產生更多的TF促發(fā)進一步凝血反應,從而特異性梗塞腫瘤血管。 鑒于以上基礎,本研究將制備包載血卟啉單甲醚的EGF1-EGFP-NP,選取高表達TF的腦微血管內皮細胞(BMECs)作為腫瘤血管內皮模型,選取CA46淋巴瘤細胞復制動物實體瘤模型,體內及體外研究該納米粒在冷光源激發(fā)下,是否能靶向到高表達TF的腫瘤血管內皮?是否能激發(fā)局部TF的進一步釋放及載血卟啉單甲醚納米粒子的不斷聚集,導致局部的血栓形成?是否可中斷腫瘤細胞的血液供應,發(fā)揮抗腫瘤效應?期望能為實體腫瘤的治療提供新的思路。 第一部分載血卟啉單甲醚的EGFP-EGF1蛋白結合聚乙二醇—聚乳酸—聚羥基乙酸納米粒的構建及體外評價目的 將血卟啉單甲醚載入EGFP-EGF1蛋白結合聚乙二醇—聚乳酸—聚羥基乙酸納米粒中,并對該納米粒的理化性質進行鑒定：驗證HMME-ENP對腦微血管內皮細胞(BMECs)的靶向性；評價在冷光源照射下HMME-ENP誘導BMECs產生活性氧和組織因子的作用。 方法 1)采用單乳法,合成出包載血卟啉單甲醚的PLGA納米粒(HMME-NP),之后將EGFP-EGF1蛋白巰基化,連接于HMME-NP表面,合成出MME-ENP;通過粒徑測定儀對納米粒的粒徑進行測定；通過普通電鏡觀察納米粒的形態(tài),并通過BCA法測定納米粒的EGFP-EGF1蛋白連接效率；提取納米粒中的血卟啉單甲醚,計算血卟啉單甲醚的載藥量。 2)兩次消化加Percoll梯度離心法提取大鼠BMECs, TNFα上調BMECs TF的表達,構建體外血管損傷模型；在ENP納米粒表面連接香豆素-6示蹤納米粒,進行細胞攝取實驗；通過Dihydroethidium (DHE)超氧化物陰離子熒光探針檢測BMECs細胞光照后活性氧產生情況；通過實時定量PCR和western-blot,檢測BMECs細胞光照后TF表達水平的改變。 結果 1)載入血卟啉單甲醚的ENP (HMME-ENP)粒徑大小約110-120rnm左右,外觀大小均一、圓整。HMME-ENP納米粒表面EGFP-EGF1蛋白連接效率為39.27%。血卟啉單甲醚的載藥量約4.24ug/mg。 2)大鼠BMECs原代細胞存在TF的少量表達,TNF (100ng/ml,6h)可以刺激細胞上調TF表達；細胞攝取實驗顯示,連接有EGF1-EGFP蛋白的ENP比NP更利于細胞攝��； 3)在冷光源照射下,HMME-ENP可以誘導BMECs細胞產生活性氧和促進TF表達,且作用強于HMME-NP誘導的。 結論 1) HMME-ENP粒徑大小均一,EGFP-EGF1蛋白的成功連接,HMME的載藥量都可滿足后續(xù)實驗需求; 2) HMME-ENP體外血管損傷模型中具有TF靶向性： 3)在冷光源作用下,HMME-ENP納米粒中包載的HMME可以促進活性氧產生及TF表達。 第二部分載血卟啉單甲醚的EGFP-EGF1蛋白結合聚乙二醇—聚乳酸—聚羥基乙酸納米粒在小鼠淋巴瘤皮下瘤模型中的評價 目的 構建小鼠淋巴瘤的皮下瘤模型；用Dir示蹤MME-NP納米粒,在淋巴瘤皮下瘤模型中,進一步驗證其TF靶向性；初步評價冷光源照射下,MME-ENP對小鼠淋巴瘤的干預作用。 方法 1)以NOD/Scid小鼠為種瘤對象,挑選淋巴瘤細胞系CA46細胞以1*107的密度終種植在小鼠右側肩胛區(qū)皮下： 2)成瘤小鼠尾靜脈分別注射Dir標記的HMME-ENP及HMME-NP,冷光源照射局部瘤體后給予活體成像,觀察2h、6h、12h、24h等各時間點納米粒在小鼠體內的分布；24h點處死小鼠,取心、腦、肝臟、脾臟、腎、肺、瘤體等進行器官成像,計算組織熒光強度； 3)免疫熒光檢測小鼠瘤體冰凍切片的活性氧和TF分布；HE染色檢測血栓；結果 1)CA46細胞種植3-4周后,80%以上NOD/Scid小鼠均可見瘤細胞種植部位皮下瘤的形成； 2)活體成像結果顯示：a)在2h、6h、12h、24h等各時間點,尾靜脈注射ENP的小鼠瘤體處納米粒聚集均強于注射NP小鼠；給予光照后,尾靜脈注射ENP的納米粒聚集仍強于NP聚集; b)給予光照后,尾靜脈注射ENP的納米粒聚集強于未光照組ENP聚集;光照后尾靜脈注射NP的納米粒聚集強于未光照組NP聚集； c)給予光照后,尾靜脈注射ENP的納米粒聚集在2h、6h、12h、24h等所有時間點中,6h達最高。 3)器官成像顯示：a)24h點納米粒在肝臟的聚集最多,其次為脾臟、瘤體;b)余結果與上述活體成像吻合； 4)瘤體冰凍切片免疫熒光顯示納米粒聚集的部位與TF表達區(qū)域吻合： 5)注射ENP的小鼠瘤體活性氧、血栓及TF表達等均較注射NP的。 結論 1)ENP在小鼠淋巴瘤皮下瘤模型中具有靶向性; 2)在冷光源局部照射下,HMME-ENP可以促進瘤體產生更多的活性氧、TF、和血栓,有望為腫瘤靶向治療提供一個新的策略。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R733.1

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