【摘要】：目的:肝癌是世界上常見的一種癌癥,它的發(fā)病率在很多國家都呈增趨勢加。在中國,男性患者中的發(fā)病率也排名前五。手術(shù)切除、肝移植以及局部放療等被認(rèn)為是有效的治療措施。然而,經(jīng)過治療后,肝癌的五年復(fù)發(fā)率仍然很高,有很多因素與高復(fù)發(fā)率有關(guān)。近年來,隨著糖尿病患者數(shù)量的增加,肝癌合并糖尿的患者數(shù)量也在增加。血糖的控制也被認(rèn)為是影響肝癌進(jìn)展及其預(yù)后的一項危險因素。而高糖濃度對肝癌細(xì)胞功能影響的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及RNA與蛋白質(zhì)表達(dá)水平的研究尚不多見。本研究將通過蛋白組學(xué)技術(shù),以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白變化為切入點,篩選候選蛋白質(zhì)并對不同糖濃度條件下,影響該蛋白表達(dá)的機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究,初步建立一條調(diào)控途徑,在基因水平和蛋白水平探索高糖濃度對肝癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展和功能的影響。方法:1、運(yùn)用Label-free蛋白組學(xué)方法分析高糖對人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系(HepG2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的影響:體外條件下培養(yǎng)人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系(HepG2),分為正常對照組(DMEM低糖培養(yǎng)基,葡萄糖濃度為5.6mol/L)和高糖對照組(DMEM高糖培養(yǎng)基,葡萄糖濃度為25mmol/L)。利用超速離心及密度梯度離心技術(shù),對HepG2細(xì)胞進(jìn)行亞細(xì)胞的分離與鑒定,分離中較為純化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。運(yùn)用Label-free蛋白組學(xué)方法,對分離出的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行質(zhì)譜分析,得到差異化蛋白結(jié)果。2、利用生物信息學(xué)方法,對差異化蛋白進(jìn)行篩選,挑選出與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能相關(guān)的蛋白ERP29進(jìn)行進(jìn)一步機(jī)制的研究。在細(xì)胞層面利用western法驗證高糖對ERP29表達(dá)的影響,在組織層面采用免疫組化技術(shù)對糖尿病與非糖尿病肝癌組織石蠟切片進(jìn)行ERP29的染色3、分析ERP29對肝癌細(xì)胞(HepG2)生物學(xué)行為的影響:采用人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系(HepG2)分為正常對照組(DMEM低糖培養(yǎng)基,含葡萄糖為5.6mmol/L)、高糖干預(yù)組(DMEM高糖培養(yǎng)基,含葡萄糖為25mmol/L)、高糖ERP29過表達(dá)組以及高糖ERP29低表達(dá)組,利用CCK-8、細(xì)胞劃痕試驗揭示ERP29對HepG2細(xì)胞增殖、遷移功能的影響,用western blot技術(shù)檢測E-cadherin、Vimentin和N-cadherin等上皮間質(zhì)化現(xiàn)象相關(guān)的蛋白表達(dá)的影響。4、探尋調(diào)控ERP29的miRNA:通過查找miRNA數(shù)據(jù)庫(Tarbase,TargetScanHuman,miRTargetLink Human等),篩選出與ERP29可能相關(guān)的miRNA。對候選miRNA在高糖和低糖條件下做RT-PCR后進(jìn)一步篩選miRNA。將人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系分為,高糖miRNA mimics組、高糖miRNA inhibitor組、高糖對照組和正常對照組。轉(zhuǎn)染相應(yīng)試劑后,利用PCR法驗證miR-483-3p水平,并用Western Blotting檢測ERP29的表達(dá)量變化,驗證miR-483-3p的變化是否影響ERP29的表達(dá)。進(jìn)一步采用CCK8、劃痕試驗驗證miR-483-3p對HepG2細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)行為的影響。5、進(jìn)一步揭示調(diào)控mir-483-3p的上游LncRNA再通過LncRNA數(shù)據(jù)庫(LncBase,Starbase)篩選出與mir-483-3p有關(guān)的LncRNA。對候選LncRNA在高糖和低糖條件下做RT-PCR后進(jìn)一步篩選。人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系(HepG2)分為正常對照組、高糖對照組、高糖MEG3過表達(dá)組和高糖空載體組。各組細(xì)胞分別干預(yù)不同時間(0、24h、48h、72h)后,用熒光定量PCR法檢測MEG3和miR-483-3p以及用Western Blotting法檢測ERP29的表達(dá)量變化,并進(jìn)行對比。進(jìn)一步采用利用CCK8、劃痕試驗證實LncRNA MEG3HepG2細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)行為的影響。結(jié)果:1、成功分離內(nèi)質(zhì)網(wǎng)亞細(xì)胞器成分,運(yùn)用label-free方法篩選出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白ERP29。2、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系在不同糖濃度條件下分別干預(yù)24h、48h、72h后,Western Blotting結(jié)果顯示,與正常對照組相比,高糖組ERP29表達(dá)量在72h顯著下降(P0.05),而24h、48h的表達(dá)量組間并沒有明顯差距。3、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,與正常肝組織相比,肝癌合并以及不合并糖尿病組的患者石蠟切片ERP29染色均降低,且肝癌合并糖尿病組ERP29染色進(jìn)一步降低。4、過表達(dá)及敲減ERP29后,CCK-8和細(xì)胞劃痕試驗表明,過表達(dá)組細(xì)胞增殖和遷移能力下降,而敲減組增殖和遷移能力上升。同時對上皮間質(zhì)化標(biāo)記物驗證后發(fā)現(xiàn),過表達(dá)組上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)量下降,間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin和N-cadherin的表達(dá)量上升(p0.05),敲減組結(jié)果相反(p0.05)。5、轉(zhuǎn)染miR-483-3p的mimics和inhibitor后培養(yǎng)24h、48h后,Western Blot顯示,與正常對照組及高糖對照組相比,mimics組ERP29表達(dá)水平均明顯下降(p0.05),而inhibitor組ERP29表達(dá)水平明顯增加(p0.05)。同時,CCK-8和劃痕試驗表明,mimics組HepG2細(xì)胞增殖和侵襲能力增加,而inhibitor組增殖和侵襲能力下降(p0.05)。6、轉(zhuǎn)染MEG3質(zhì)粒后培養(yǎng)24h、48h,RT-PCR結(jié)果顯示,與正常對照組相比,過表達(dá)組miR-483-3p表達(dá)水平降低,且下游ERP29表達(dá)水平增加(p0.05)。CCK-8和劃痕試驗表明,過表達(dá)MEG3組HepG2細(xì)胞增殖和侵襲能力下降。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),敲減miR-483-3p后再過表達(dá)MEG3,下游ERP29的表達(dá)水平并沒有發(fā)生變化(p0.05)。7、初步建立LncRNA MEG3-miR-483-3p-ERP29的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。LncRNA MEG3可能通過miR-483-3p影響ERP29的表達(dá),進(jìn)一步影響HepG2細(xì)胞的功能。ERP29對HepG2細(xì)胞功能的影響可能通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑,使肝癌細(xì)胞極性喪失,遷移和運(yùn)動能力增強(qiáng)。
【圖文】：

19圖 1.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分離與鑒定A.蔗糖梯度密度離心示意圖；B.密度梯度離心后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成分聚積位置；C.細(xì)胞器特異性標(biāo)記物的檢測。(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記物：calreticulin；線粒體標(biāo)記物：COXIV;高爾基體標(biāo)記物：58k Golg細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記物：β-actinTotal:細(xì)胞總蛋白；P1:1000 轉(zhuǎn)離心后沉淀；S1：1000 轉(zhuǎn)離心后上清；P8：800轉(zhuǎn)離心后沉淀；S8：8000 轉(zhuǎn)離心后上清；ER：圖 1.B 畫圈成分）

圖 2.不同分組患者肝組織 ERP29 組化染色比較1.3.4 HepG2 細(xì)胞中不同糖濃度條件下的 ERP29 表達(dá)情況與正常對照組（5.6mmol/L）相比，高糖干預(yù)組（25mmol/L）ERP29 的表達(dá)在 24h、48h 時未發(fā)現(xiàn)明顯的差異。而在 72h 時，，高糖干預(yù)組 ERP29 蛋白表達(dá)水平下降明顯，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。對 HepG2 細(xì)胞高糖條件下繼續(xù)干預(yù)，使干預(yù)時間達(dá)到 96h，未發(fā)現(xiàn) ERP29 表達(dá)有回調(diào)趨勢，與正常對照組相比下降趨勢仍十分明顯，且有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。Western Blot 對 ERP29 在高糖下干預(yù)的表達(dá)結(jié)果，與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果基本一致，并進(jìn)一步證實，ERP29 在高糖干預(yù)下發(fā)生表達(dá)水平下調(diào)發(fā)生在 48h 之后。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7;R587.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 謝作斌;王友群;;ERp29——一種新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白[J];醫(yī)學(xué)綜述;2009年03期

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1 郭春梅;miR-429靶向作用于CRKL通過調(diào)控Raf/MEK/ERK-EMT通路抑制HepG2細(xì)胞遷移、侵襲[D];大連醫(yī)科大學(xué);2017年

2 朱娟娟;LncRNA MEG3在肝癌細(xì)胞中的功能及作用機(jī)制研究[D];吉林大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 韓娉怡;ERp29與Arp3在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)和意義[D];中南大學(xué);2012年

本文編號：2673016