【摘要】：目的:肝癌是世界上常見的一種癌癥,它的發(fā)病率在很多國家都呈增趨勢加。在中國,男性患者中的發(fā)病率也排名前五。手術切除、肝移植以及局部放療等被認為是有效的治療措施。然而,經(jīng)過治療后,肝癌的五年復發(fā)率仍然很高,有很多因素與高復發(fā)率有關。近年來,隨著糖尿病患者數(shù)量的增加,肝癌合并糖尿的患者數(shù)量也在增加。血糖的控制也被認為是影響肝癌進展及其預后的一項危險因素。而高糖濃度對肝癌細胞功能影響的調控網(wǎng)絡及RNA與蛋白質表達水平的研究尚不多見。本研究將通過蛋白組學技術,以內質網(wǎng)的蛋白變化為切入點,篩選候選蛋白質并對不同糖濃度條件下,影響該蛋白表達的機制進行進一步研究,初步建立一條調控途徑,在基因水平和蛋白水平探索高糖濃度對肝癌細胞發(fā)生發(fā)展和功能的影響。方法:1、運用Label-free蛋白組學方法分析高糖對人肝細胞癌細胞系(HepG2)內質網(wǎng)蛋白的影響:體外條件下培養(yǎng)人肝細胞癌細胞系(HepG2),分為正常對照組(DMEM低糖培養(yǎng)基,葡萄糖濃度為5.6mol/L)和高糖對照組(DMEM高糖培養(yǎng)基,葡萄糖濃度為25mmol/L)。利用超速離心及密度梯度離心技術,對HepG2細胞進行亞細胞的分離與鑒定,分離中較為純化的內質網(wǎng)。運用Label-free蛋白組學方法,對分離出的內質網(wǎng)進行質譜分析,得到差異化蛋白結果。2、利用生物信息學方法,對差異化蛋白進行篩選,挑選出與內質網(wǎng)功能相關的蛋白ERP29進行進一步機制的研究。在細胞層面利用western法驗證高糖對ERP29表達的影響,在組織層面采用免疫組化技術對糖尿病與非糖尿病肝癌組織石蠟切片進行ERP29的染色3、分析ERP29對肝癌細胞(HepG2)生物學行為的影響:采用人肝細胞癌細胞系(HepG2)分為正常對照組(DMEM低糖培養(yǎng)基,含葡萄糖為5.6mmol/L)、高糖干預組(DMEM高糖培養(yǎng)基,含葡萄糖為25mmol/L)、高糖ERP29過表達組以及高糖ERP29低表達組,利用CCK-8、細胞劃痕試驗揭示ERP29對HepG2細胞增殖、遷移功能的影響,用western blot技術檢測E-cadherin、Vimentin和N-cadherin等上皮間質化現(xiàn)象相關的蛋白表達的影響。4、探尋調控ERP29的miRNA:通過查找miRNA數(shù)據(jù)庫(Tarbase,TargetScanHuman,miRTargetLink Human等),篩選出與ERP29可能相關的miRNA。對候選miRNA在高糖和低糖條件下做RT-PCR后進一步篩選miRNA。將人肝細胞癌細胞系分為,高糖miRNA mimics組、高糖miRNA inhibitor組、高糖對照組和正常對照組。轉染相應試劑后,利用PCR法驗證miR-483-3p水平,并用Western Blotting檢測ERP29的表達量變化,驗證miR-483-3p的變化是否影響ERP29的表達。進一步采用CCK8、劃痕試驗驗證miR-483-3p對HepG2細胞增殖、遷移等生物學行為的影響。5、進一步揭示調控mir-483-3p的上游LncRNA再通過LncRNA數(shù)據(jù)庫(LncBase,Starbase)篩選出與mir-483-3p有關的LncRNA。對候選LncRNA在高糖和低糖條件下做RT-PCR后進一步篩選。人肝細胞癌細胞系(HepG2)分為正常對照組、高糖對照組、高糖MEG3過表達組和高糖空載體組。各組細胞分別干預不同時間(0、24h、48h、72h)后,用熒光定量PCR法檢測MEG3和miR-483-3p以及用Western Blotting法檢測ERP29的表達量變化,并進行對比。進一步采用利用CCK8、劃痕試驗證實LncRNA MEG3HepG2細胞增殖、遷移等生物學行為的影響。結果:1、成功分離內質網(wǎng)亞細胞器成分,運用label-free方法篩選出內質網(wǎng)相關蛋白ERP29。2、人肝細胞癌細胞系在不同糖濃度條件下分別干預24h、48h、72h后,Western Blotting結果顯示,與正常對照組相比,高糖組ERP29表達量在72h顯著下降(P0.05),而24h、48h的表達量組間并沒有明顯差距。3、免疫組織化學染色結果顯示,與正常肝組織相比,肝癌合并以及不合并糖尿病組的患者石蠟切片ERP29染色均降低,且肝癌合并糖尿病組ERP29染色進一步降低。4、過表達及敲減ERP29后,CCK-8和細胞劃痕試驗表明,過表達組細胞增殖和遷移能力下降,而敲減組增殖和遷移能力上升。同時對上皮間質化標記物驗證后發(fā)現(xiàn),過表達組上皮標志物E-cadherin的表達量下降,間質標志物Vimentin和N-cadherin的表達量上升(p0.05),敲減組結果相反(p0.05)。5、轉染miR-483-3p的mimics和inhibitor后培養(yǎng)24h、48h后,Western Blot顯示,與正常對照組及高糖對照組相比,mimics組ERP29表達水平均明顯下降(p0.05),而inhibitor組ERP29表達水平明顯增加(p0.05)。同時,CCK-8和劃痕試驗表明,mimics組HepG2細胞增殖和侵襲能力增加,而inhibitor組增殖和侵襲能力下降(p0.05)。6、轉染MEG3質粒后培養(yǎng)24h、48h,RT-PCR結果顯示,與正常對照組相比,過表達組miR-483-3p表達水平降低,且下游ERP29表達水平增加(p0.05)。CCK-8和劃痕試驗表明,過表達MEG3組HepG2細胞增殖和侵襲能力下降。進一步研究發(fā)現(xiàn),敲減miR-483-3p后再過表達MEG3,下游ERP29的表達水平并沒有發(fā)生變化(p0.05)。7、初步建立LncRNA MEG3-miR-483-3p-ERP29的調控網(wǎng)絡。LncRNA MEG3可能通過miR-483-3p影響ERP29的表達,進一步影響HepG2細胞的功能。ERP29對HepG2細胞功能的影響可能通過上皮間質轉化途徑,使肝癌細胞極性喪失,遷移和運動能力增強。
【圖文】：

19圖 1.內質網(wǎng)的分離與鑒定A.蔗糖梯度密度離心示意圖；B.密度梯度離心后內質網(wǎng)成分聚積位置；C.細胞器特異性標記物的檢測。(內質網(wǎng)標記物：calreticulin；線粒體標記物：COXIV;高爾基體標記物：58k Golg細胞質標記物：β-actinTotal:細胞總蛋白；P1:1000 轉離心后沉淀；S1：1000 轉離心后上清；P8：800轉離心后沉淀；S8：8000 轉離心后上清；ER：圖 1.B 畫圈成分）

圖 2.不同分組患者肝組織 ERP29 組化染色比較1.3.4 HepG2 細胞中不同糖濃度條件下的 ERP29 表達情況與正常對照組（5.6mmol/L）相比，高糖干預組（25mmol/L）ERP29 的表達在 24h、48h 時未發(fā)現(xiàn)明顯的差異。而在 72h 時，，高糖干預組 ERP29 蛋白表達水平下降明顯，有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。對 HepG2 細胞高糖條件下繼續(xù)干預，使干預時間達到 96h，未發(fā)現(xiàn) ERP29 表達有回調趨勢，與正常對照組相比下降趨勢仍十分明顯，且有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。Western Blot 對 ERP29 在高糖下干預的表達結果，與蛋白質組學結果基本一致，并進一步證實，ERP29 在高糖干預下發(fā)生表達水平下調發(fā)生在 48h 之后。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7;R587.1

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 謝作斌;王友群;;ERp29——一種新的內質網(wǎng)蛋白[J];醫(yī)學綜述;2009年03期

相關博士學位論文 前2條

1 郭春梅;miR-429靶向作用于CRKL通過調控Raf/MEK/ERK-EMT通路抑制HepG2細胞遷移、侵襲[D];大連醫(yī)科大學;2017年

2 朱娟娟;LncRNA MEG3在肝癌細胞中的功能及作用機制研究[D];吉林大學;2014年

相關碩士學位論文 前1條

1 韓娉怡;ERp29與Arp3在原發(fā)性肝細胞癌中的表達和意義[D];中南大學;2012年

本文編號：2673016