發(fā)布時間：2020-05-20 13:57

【摘要】：目的:皮膚鱗狀細胞癌(cSCC)是皮膚常見的惡性腫瘤之一,侵襲性強是影響其預后的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)皮膚鱗癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移與腫瘤細胞自噬有關(guān);課題組前期在cSCC中研究證實Rab23可促進皮膚鱗癌細胞的侵襲,而且鱗癌組織自噬水平升高與鱗癌進展關(guān)系密切;然而,Rab23對鱗癌自噬水平的影響還不明確,特別是Rab23在皮膚鱗癌細胞自噬促進腫瘤侵襲的作用及分子調(diào)控機制尚不明確。因此,本課題擬明確Rab23是否影響鱗癌細胞自噬,并進一步探討Rab23在皮膚鱗癌細胞自噬促進腫瘤侵襲中的作用及分子機制。方法:①通過GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫下載基因表達原始數(shù)據(jù),利用生物信息學方法對頭頸部鱗癌組織中Rab23與自噬及侵襲相關(guān)的分子表達水平進行分析,初步探討Rab23與鱗癌自噬及侵襲的關(guān)系,進一步分析Rab23與自噬標記分子異常共表達對患者生存率的影響;②利用課題組已經(jīng)建立的解放軍總醫(yī)院皮膚科病理組織標本庫資源,免疫組化檢測41例皮膚鱗癌組織、49例光線性角化病與30例頭面部色素痣切除后邊緣正常皮膚組織中Rab23的表達水平,對標本庫中同期保存的上述組織自噬標記蛋白Beclin1、LC3B及p62免疫組化切片,深度分析Rab23的表達水平與自噬相關(guān)蛋白表達的相關(guān)性及與臨床病理特征的關(guān)系;③利用課題組前期構(gòu)建的轉(zhuǎn)染表達不同Rab23水平的細胞系,激光共聚焦觀察Rab23對自噬囊泡數(shù)量的影響以及是否與自噬囊泡共定位;蛋白免疫印跡檢測Rab23對自噬標記蛋白Beclin1、LC3B及p62水平的影響,以及調(diào)控自噬相關(guān)信號通路AKT/mTOR、MEK/ERK1/2;④最后通過基因干擾Atg5的表達、藥物抑制或激活細胞的自噬水平,觀察Rab23對鱗癌自噬促進腫瘤細胞侵襲病理過程的影響。結(jié)果:①生物信息學分析結(jié)果示:在所有基因表達芯片中,與正常組織相比,在轉(zhuǎn)錄水平均未發(fā)現(xiàn)自噬標記物Beclin1、LC3B表達水平明顯升高。高表達MMP1 mRNA見于上皮性癌的整個病變過程,Rab23與MMP1表達呈正相關(guān)關(guān)系(P0.05或P0.01);Rab23 表達與 HIF1A、MAPK8 和 ARFGAP1 呈正相關(guān)(P0.01),但與 mTOR、BCL2L1表達呈負相關(guān)(P0.05或P0.01)。高表達Rab23 mRNA可促進皮膚鱗癌神經(jīng)侵襲。TCGA分析結(jié)果與Rab23單一因素相比,Rab23聯(lián)合自噬相關(guān)標記分子Beclin1、LC3B及p62的表達異常,患者總生存率(OS)下降(P0.05),無病生存率(DFS)有降低趨勢,盡管無統(tǒng)計學意義(P0.05)②Rab23及自噬相關(guān)蛋白在皮膚鱗癌、光線性角化病中表達水平:與正常皮膚組織相比,免疫組化檢測結(jié)果顯示Rab23和自噬標記物Beclin1、LC3B在光線性角化病、皮膚鱗癌中表達水平逐漸升高,而p62水平逐漸降低(P0.01);組間兩兩比較,從正常組織、光線性角化病到皮膚鱗癌,除LC3B在光線性角化病與正常組織之間,以及p62在皮膚鱗癌與光線性角化病之間無差別外,其余組間比較均有統(tǒng)計學意義(P0.01);Rab23表達與自噬標記物Beclin1、LC3B表達呈正相關(guān)關(guān)系,與p62表達呈負相關(guān)(P0.01);Rab23、Beclin1、LC3B及p62與腫瘤分化級別有關(guān)(P0.05或P0.01),其中 LC3B、Beclin1 與臨床分期關(guān)系顯著(P0.05或P0.01),而且 Beclin1與腫瘤大小有關(guān)(P0.05);Rab23、LC3B、Beclin1及p62的蛋白表達水平與患者病程、年齡、性別,侵襲關(guān)系不明顯(P0.05)。③激光共聚焦結(jié)果顯示與EGFP標記的空載體組(Vector)相比,EGFP標記Rab23野生型(Rab23WT)和Rab23持續(xù)活化型(Rab23Q68L)可以增加自噬囊泡的數(shù)量(P0.01),并且與其共定位,而Rab23持續(xù)抑制型(Rab23S23N)和Vector組自噬囊泡數(shù)量減少,自噬活化與GTP結(jié)合形式有關(guān);蛋白免疫印跡結(jié)果顯示與Vector組相比,Rab23 WT和Rab23Q68L組可以促進皮膚鱗癌細胞Beclin1、LC3B表達水平(P0.05或P0.01);Rab23-WT 和 Rab23Q68L 組 p-mTOR 和 p-ERK 表達均升高(P0.05 或P0.01)。Rab23通過正向調(diào)控ERK和mTOR的表達,最終促進鱗癌細胞的自噬。給予自噬促進劑雷帕霉素及自噬抑制劑氯喹處理后,鱗癌細胞Beclin1、LC3B和p62的自噬水平呈升高或降低的趨勢。④Rab23WT和Vector組轉(zhuǎn)染Atg5siRNA后,細胞自噬水平下降,侵襲能力、遷移能力和創(chuàng)傷愈合能力均減弱。與轉(zhuǎn)染Atg5-siRNA的Vector組相比,轉(zhuǎn)染Atg5-siRNA Rab23WT組侵襲能力、遷移能力和創(chuàng)傷愈合能力均增強(P0.05),接近于轉(zhuǎn)染Atg5-siRNA-NC Vector 細胞組,但仍小于轉(zhuǎn)染 Atg5-siRNA-NC Rab23WT 細胞組(P0.05)。變化趨勢:轉(zhuǎn)染 Atg5-siRNAVector 細胞組轉(zhuǎn)染 Atg5-siRNARab23WT細胞組≈轉(zhuǎn)染 Atg5-siRNA-NC Vector 細胞組轉(zhuǎn)染 Atg5-siRNA-NC Rab23WT 細胞組。給予氯喹(40uM)和雷帕霉素(50nM)處理后,細胞侵襲能力、遷移能力和創(chuàng)合愈合能力均降低,變化趨勢與基因干擾Atg5表達相一致。結(jié)論:①Rab23可以促進基質(zhì)金屬蛋白酶MMP1mRNA表達,二者呈正相關(guān)關(guān)系;②皮膚鱗癌組織中Rab23及自噬相關(guān)基因HIF1A、MAPK8 mRNA表達上調(diào),mTOR、BCL2L1表達下調(diào),促進皮膚鱗癌神經(jīng)侵襲;③Rab23和自噬標記分子Beclin1、LC3B及p62mRNA異常共表達,患者總生存率下降;④皮膚鱗癌組織中Rab23高表達,且與鱗癌自噬水平、分化程度及臨床分期相關(guān);⑤Rab23可以促進皮膚鱗癌細胞自噬:Rab23與自噬囊泡共定位,并可增加其數(shù)量,還可以促進自噬標記蛋白Beclin1、LC3B的表達。其機制與正向調(diào)控ERK和mTOR信號通路有關(guān)。⑥抑制鱗癌細胞自噬Atg5的表達,細胞侵襲能力、遷移能力及創(chuàng)傷愈合能力明顯下降;Rab23上調(diào)皮膚鱗癌細胞自噬水平,促進皮膚鱗癌細胞的侵襲和遷移。
【圖文】：

４．３復診原則對剩余的５４７例重新閱片并進行病理學分級。由三位資深的病理逡逑醫(yī)師分別單獨復閱切片并提出診斷意見，如遇三位病理醫(yī)師診斷意見不一致，當逡逑出現(xiàn)２：１時以２個相同的診斷為病理最終診斷；當出現(xiàn)１：１：１時，則剔除該病例。逡逑經(jīng)復診共剔除病例９２例。逡逑４．４再次病例剔除標準為保證科內(nèi)存檔資料的完整性以便于滿足患者后續(xù)的逡逑醫(yī)療需求，對復診后所得４８２例病例的組織塊進行評估，符合以下條件之一者即逡逑剔除：１）病理歸檔蠟塊不齊全者；２）組織較小，蠟塊中組織的最大面積切．５ｘ０．５ｃｍ２；逡逑３）送檢俎織雖然較多，但綜合ＨＥ切片，同一病例中任意一張切片中具實際診逡逑斷意義的腫瘤組織面積均切．５ｘ０．５ｃｍ２；共剔除病例１８４例。逡逑５．入組病例經(jīng)過上述嚴格的原始病例檢索、整理、樣本含量估計、隨機化抽逡逑樣、病理學復診、病例篩選、剔除、復閱并重新分級及再次剔除，，最終剩余２９８逡逑

２０１０－２０１６年７年間中國人民解放軍總醫(yī)院共診治膀胱ＵＮ３６１０例，其中呈逡逑外生性乳頭狀生長者３２４０例（８９．７５％），內(nèi)翻性生長者３２７例（９．０６％），平坦逡逑型非浸潤性者４３例（１．１９％）（圖２）。逡逑內(nèi)翻性，３２７例平坦型，４３例，逡逑９．０６％邐＼邐廠一邋１．１９％逡逑圖２．邋２０１０？２０１６年間中國人民解放軍總醫(yī)院診治非特殊類型膀胱ＵＮ生長方式分布圖逡逑經(jīng)過隨機抽樣、病例篩選及復診，剔除質(zhì)量不合格以及三位閱片專家意見不逡逑一致的病例，剩余４８２例，重新分類前外生性ＵＮ２４９例，內(nèi)翻性ＵＮ２３３例；按生逡逑長方式重新分類后外生性者２１６例，內(nèi)翻性者２６６例，其中４１例由外生組移入內(nèi)翻逡逑組，８例由內(nèi)翻組移入外生組，此外２例內(nèi)翻性非浸潤ＵＮ、２例外生性非浸潤性逡逑ＵＮ以及２３例外生性浸潤癌均移入內(nèi)翻性浸潤癌組中（見表３邋）。逡逑４８２例ＵＮ經(jīng)二次剔除不符合要求的病例后剩余２９８例，其中經(jīng)生長方式調(diào)整逡逑的病例主要集中在浸潤性癌中，原診斷為外生性浸潤性癌中的２０例（４２．５５％）調(diào)逡逑整為內(nèi)翻性浸潤性癌
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.5

【參考文獻】

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1 王s

本文編號：2672723