【摘要】：目的通過研究人黑素瘤細胞系A375和MEL624對B-Raf抑制劑達拉菲尼誘導耐藥性的機制,探討內質網應激在黑素瘤自噬中的作用機制。首先研究B-Raf抑制劑達拉菲尼是否可以在兩種黑色素瘤細胞系中引起自噬和內質網應激。其次,達拉菲尼誘導的自噬是否通過內質網應激調控。最后,阻斷內質網應激和自噬是否可以增加達拉菲尼治療黑色素瘤細胞的功效。方法1、常規(guī)體外培養(yǎng)黑素瘤細胞系A375和MEL624,將黑素瘤細胞系A375和MEL624分別用濃度為0nM、10nM、100nM、250nM、500nM的達拉菲尼處理,24小時后用Western blot分別檢測兩種細胞系的自噬相關蛋白LC3I/II和P62以及內質網應激相關蛋白p-PERK和CHOP的表達情況。2、脂質體2000轉染黑素瘤細胞制備針對PERK的小干擾RNA(PERK-siRNA)和非目標控制小干擾RNA(NTC-siRNA),針對PERK的小干擾RNA將PERK蛋白水平降低大約70%。用達拉菲尼(100nM)處理兩種細胞系的PERK-siRNA和NTC-siRNA,設置空白對照組,24小時后將細胞收集并通過Western blot檢測CHOP、IRE1α、P62、LC3I/II在兩種細胞系中的表達情況。3、用內質網應激抑制劑4-苯基丁酸(4PBA 10nM)處理人黑色素瘤細胞A375和MEL624 1小時,隨后用達拉菲尼(100nM)處理24小時,同時設置空白對照組。收集細胞并通過CCK-8檢測細胞生存能力。4、在黑素瘤細胞系A375和MEL624中添加自噬抑制劑3-甲基腺苷(3-MA 2nM),同時設置空白對照組,然后用不同濃度的達拉菲尼處理兩種黑素瘤細胞系24小時。處理結束后,通過CCK-8檢測細胞生存能力。結果1、Western blot分別檢測黑素瘤細胞系A375和MEL624的LC3I/II和P62表達水平發(fā)現隨達拉菲尼濃度的升高,LC3I/II的表達水平顯著增高,同時伴有P62表達水平顯著下降。用上述同樣方法,Western blot分別檢測兩種細胞系的p-PERK和CHOP表達水平發(fā)現p-PERK和CHOP表達水平隨達拉菲尼濃度升高而表達水平增高。2、使用小干擾RNA將PERK基因敲低后,PERK蛋白表達水平降低大約70%。通過Western blot分別檢測發(fā)現,PERK敲低后,CHOP、IRE1α表達量減少;同時,P62表達量增加,LC3II/I表達量減少。3、僅用達拉菲尼處理組與同時應用4-苯基丁酸處理組相比細胞存活率更高。4、與3-甲基腺苷同時處理組相比,僅用達拉菲尼組細胞存活率更高。結論1、在黑素瘤細胞中,B-Raf抑制劑誘導的自噬和內質網應激呈劑量依賴性。2、在黑素瘤細胞中,抑制內質網應激可調節(jié)自噬水平。3、內質網應激可保護黑素瘤細胞免受B-Raf抑制劑介導的細胞凋亡。4、內質網應激誘導的自噬可保護黑素瘤細胞免受B-Raf抑制劑介導的細胞凋亡。
【圖文】：

黑素瘤細胞系A375和MEL624分別用濃度為0nM、10nM、100nM、250nM、500nM的達拉菲尼處理24小時后，用Western blot分別檢測黑素瘤細胞系A375和MEL624的LCI/II和P62表達水平（圖1A和B），發(fā)現隨達拉菲尼濃度的升高LC3I/II的水平顯著增高，同時伴有顯著的P62水平下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。用上述同樣方法，Western blot分別檢測黑素瘤細胞系A375和MEL624的p-PERK和CHOP表達水平（圖2A和B）發(fā)現p-PERK和CHOP表達水平隨達拉菲尼濃度升高而表達水平增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。A

同時伴有顯著的P62水平下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。用上述同樣方法，，Western blot分別檢測黑素瘤細胞系A375和MEL624的p-PERK和CHOP表達水平（圖2A和B）發(fā)現p-PERK和CHOP表達水平隨達拉菲尼濃度升高而表達水平增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。A
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.5

【參考文獻】

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1 Mohamed Hassan;Denis Selimovic;Matthias Hannig;Youssef Haikel;Robert T Brodell;Mossaad Megahed;;Endoplasmic reticulum stress-mediated pathways to both apoptosis and autophagy: Significance for melanoma treatment[J];World Journal of Experimental Medicine;2015年04期

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本文編號：2670603