【摘要】：研究背景NSCLC是一種惡性程度較高的肺部腫瘤,它的侵襲性較強(qiáng),預(yù)后較差,而在所有的肺癌中,NSCLC的比例約為80%。對于NSCLC,最主要的治療為根治性的手術(shù)切除,然而由于缺乏早期特異性的診斷方法,在確診之后有很多的患者已經(jīng)失去了手術(shù)時機(jī)�；熢贜SCLC的治療策略中仍占據(jù)著不可撼動的地位,約60%的患者化療是有效的[2,3],然而化療的療效不是特別顯著[4,5]。因此,找到方法從根本上提高化療的療效從而提升NSCLC患者的無瘤生存期有著重要的意義。以CDDP為基礎(chǔ)的系統(tǒng)性及輔助性化療是NSCLC藥物治療的主要手段[6],甚至有時可以達(dá)到根治程度。但是,在使用CDDP化療時,腫瘤細(xì)胞本身固有的和/或化療后期出現(xiàn)的對CDDP藥物的抵抗極大程度的降低了治療效果,而CDDP耐藥的分子機(jī)制引發(fā)了我們的思考,因此化療增敏讓我們產(chǎn)生了極大的興趣。CK2是一種在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)大量存在的第二信使非依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[7],為一四聚體異構(gòu)而成的全酶,它包含兩個催化亞基:α和/或α,;兩個調(diào)節(jié)亞基:β。其中CK2α在其中起到主要作用,特別在NSCLC中CK2α較其他亞基有著明顯的過表達(dá),且CK2α具有癌基因的致癌效應(yīng),并與細(xì)胞的存活、凋亡、侵襲、遷移能力存在密切關(guān)系,這強(qiáng)調(diào)了CK2α與NSCLC腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的相關(guān)性。同時還有報道表明CK2α在肺癌組織、細(xì)胞中扮演著重要的角色,甚至可能成為NSCLC化學(xué)藥物治療的潛在靶點,但是其具體機(jī)制尚未明確[12]。那么對于CK2α在NSCLC的化療中所起到的作用及其機(jī)制的研究就變得尤為重要了。目的本研究旨在探討CK2α的表達(dá)與NSCLC病人的臨床指標(biāo)及預(yù)后生存關(guān)系,分析CK2α在CDDP介導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡中的作用及其可能的分子機(jī)制,由此來探索對NSCLC的聯(lián)合用藥治療,提高CDDP的化療療效,從而達(dá)到化療增敏。方法:1.在國際生物信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索確認(rèn)CK2α基因名稱:CSNK2A1,從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA,http://ualcan.path.uab.edu/index.html)數(shù)據(jù)庫中搜索CSNK2A1所對應(yīng)的數(shù)據(jù),從中查找CSNK2A1在NSCLC與正常組織中的表達(dá)差異情況。2.本研究選取了經(jīng)術(shù)后病理證實為NSCLC的病人60例,非惡性肺部腫瘤病人40例,應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測60例NSCLC癌組織、癌旁組織和40例非惡性肺部腫瘤組織中CK2α的表達(dá),分析CK2α的表達(dá)情況與病人臨床一般資料的關(guān)系。3.從基因表達(dá)綜合(Gene Expression Omnibus,GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫中下載GSE42127芯片數(shù)據(jù),樣本總共176例原發(fā)性NSCLC腫瘤組織樣本,從中找到CSNK2A1對應(yīng)探針的表達(dá)數(shù)據(jù),根據(jù)CK2α表達(dá)水平,結(jié)合病人生存時間數(shù)據(jù),繪制生存曲線。4.通過MTT法檢測CDDP時間和濃度梯度對NSCLC細(xì)胞增殖率的影響;流式細(xì)胞術(shù)(Annexin V-FITC和PI雙染)檢測CDDP濃度梯度對NSCLC細(xì)胞凋亡的影響;通過Western blot法檢測CDDP對NSCLC細(xì)胞內(nèi)Cleaved caspase-3、Cytochrome C凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響及CDDP濃度梯度對NSCLC細(xì)胞內(nèi)CK2α蛋白表達(dá)水平的影響。5.通過MTT法、平板克隆實驗、Transwell侵襲實驗、流式細(xì)胞術(shù)Rhodamine123染色法、Western blot法檢測通過抑制CK2α對CDDP作用下的NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力、細(xì)胞線粒體膜電位及細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的影響。6.通過Western blot法檢測p38 MAPK特異性抑制劑對CDDP誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡的p38 MAPK信號通路關(guān)鍵串聯(lián)蛋白表達(dá)水平的影響,通過Western blot法檢測CK2α抑制劑和si RNA基因沉默CK2α基因?qū)DDP誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞中PML蛋白表達(dá)水平的影響,通過Hochest染色法及免疫熒光觀察CK2α抑制劑對CDDP誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞內(nèi)Honest和早幼粒細(xì)胞白血病基因(promyelocytic leukemia gene,PML)蛋白表達(dá)水平的影響。以此探討抑制CK2α增強(qiáng)CDDP誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。7.通過裸鼠皮下移植NSCLC瘤模型檢測CK2α抑制劑對CDDP誘導(dǎo)體內(nèi)NSCLC腫瘤生長抑制作用的影響。8.實驗所得數(shù)據(jù)均經(jīng)過三次以上實驗重復(fù)驗證,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±SD)形式表示,所得相關(guān)數(shù)據(jù)使用SPASS Statistics 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入及分析,相關(guān)影像學(xué)統(tǒng)計使用儀器配套軟件進(jìn)行分析,計數(shù)數(shù)據(jù)采用X2檢驗,采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,并對曲線進(jìn)行l(wèi)ogrank檢驗,不同實驗組之間的數(shù)據(jù)對比,使用ANOVA進(jìn)行分析,p0.05表示存在統(tǒng)計學(xué)差異,P0.01表示存在顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果:1.TCGA數(shù)據(jù)庫中,CSNK2A1所對應(yīng)的數(shù)據(jù)顯示CK2α在肺腺癌(P0.05)、鱗癌(P0.05)組織中的陽性表達(dá)率顯著高于正常組織。2.免疫組化結(jié)果顯示CK2α在NSCLC組織、癌旁組織和非惡性肺部腫瘤組織中的陽性率分別為61.7%、11.7%和22.5%,在NSCLC組織中的表達(dá)率顯著高于癌旁組織(61.7%vs11.7%;P0.05),也高于非惡性肺部腫瘤組織(61.7%vs22.5%;P0.05)。3.統(tǒng)計分析結(jié)果顯示CK2α的陽性表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度與患者的年齡、性別、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及腫瘤的TNM分期無關(guān)(P0.05),但與NSCLC組織的病理分化程度具有顯著相關(guān)性(P0.05)。4.Kaplan-Meier曲線生存分析結(jié)果顯示,CK2α低表達(dá)者生存期較長,高表達(dá)者生存期較短(P0.05)。5.MTT法檢測NSCLC細(xì)胞增殖結(jié)果顯示:CDDP能夠抑制H157、A549、H226細(xì)胞的增殖活性,并且在一定的范圍內(nèi),CDDP對NSCLC細(xì)胞增殖的抑制呈現(xiàn)出濃度和時間的依賴性。6.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:隨著CDDP濃度的增加,H157、A549、H226細(xì)胞的早期凋亡率隨之增加。Western blot法檢測結(jié)果顯示:隨著CDDP作用濃度和時間的增加,NSCLC細(xì)胞中Cleaved caspase-3、Cytochrome C蛋白表達(dá)水平逐漸增高。7.Western blot法檢測結(jié)果顯示:隨著CDDP濃度的增加,NSCLC細(xì)胞中CK2α蛋白表達(dá)水平逐漸增高。8.MTT法檢測結(jié)果顯示:在CK2α抑制劑作用下,CDDP對NSCLC細(xì)胞的增殖抑制作用增強(qiáng);平板克隆實驗結(jié)果顯示:CK2α抑制劑可進(jìn)一步顯著增強(qiáng)CDDP對NSCLC細(xì)胞集落形成的抑制。9.Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示:CK2α抑制劑可增強(qiáng)CDDP對NSCLC細(xì)胞侵襲、遷移能力的抑制。10.流式細(xì)胞術(shù)Rhodamine 123染色法檢測結(jié)果顯示:CK2α抑制劑可進(jìn)一步增強(qiáng)CDDP對NSCLC細(xì)胞線粒體膜電位水平的下調(diào)作用。CK2α抑制劑和si RNA基因沉默CK2α基因增強(qiáng)了CDDP誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。11.抑制CK2α增強(qiáng)CDDP誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制:CDDP激活了p38 MAPK信號通路,使得p38 MAPK磷酸化,p38 MAPK磷酸化后進(jìn)一步激活CK2α,CK2α使得PML磷酸化增多,這種磷酸化的發(fā)生導(dǎo)致了蛋白酶介導(dǎo)的多聚泛素化的PML降解,從而導(dǎo)致了PML下調(diào)。而抑制CK2α,PML的磷酸化減少,蓄積增多,從而增強(qiáng)了CDDP對NSCLC細(xì)胞的凋亡效應(yīng)。12.裸鼠皮下移植瘤實驗結(jié)果顯示:與生理鹽水對照組相比,TBB給藥組的生長抑制不明顯,CDDP給藥組和CDDP聯(lián)合TBB給藥組的腫瘤體積和重量抑制率增高,而且CDDP聯(lián)合TBB給藥較CDDP單獨給藥,對腫瘤的生長抑制更加明顯。Western blot法檢測腫瘤組織胞漿內(nèi)相關(guān)蛋白結(jié)果顯示:CDDP聯(lián)合TBB組的Cleaved caspase-3和Cytochrome C的表達(dá)水平較TBB組、CDDP組升高,CDDP聯(lián)合TBB組的CK2α的表達(dá)水平較CDDP組降低,而PML的表達(dá)水平較CDDP組升高,結(jié)果與體外實驗相一致。結(jié)論:1.在臨床相關(guān)研究中證實了CK2α在NSCLC組織中過表達(dá),并在研究過程中發(fā)現(xiàn)了CK2α表達(dá)水平與NSCLC組織病理分化程度相關(guān),推測CK2α可能與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過程相關(guān),CK2α的表達(dá)強(qiáng)度檢測可作為判定NSCLC惡性程度的潛在指標(biāo)之一。2.蛋白激酶CK2α的過表達(dá)可能與NSCLC患者的預(yù)后相關(guān),可作為NSCLC患者的一項不良愈后指標(biāo)。3.聯(lián)合使用CDDP和CK2αsi RNA或者CDDP和CK2α抑制劑在抑制NSCLC細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和促進(jìn)NSCLC細(xì)胞凋亡方面比單獨使用CDDP更加有效。4.抑制蛋白激酶CK2α使CDDP在NSCLC化療中增敏的作用機(jī)制:CDDP激活了p38MAPK信號通路,使得p38MAPK磷酸化,p38MAPK磷酸化后進(jìn)一步激活CK2α,CK2α使得PML磷酸化增多,這種磷酸化的發(fā)生導(dǎo)致了蛋白酶介導(dǎo)的多聚泛素化的PML降解,從而導(dǎo)致了PML下調(diào)。而抑制CK2α,PML的磷酸化減少,蓄積增多,從而增強(qiáng)了CDDP對NSCLC細(xì)胞的凋亡效應(yīng),達(dá)到化療增敏。5.CK2α可能成為NSCLC分子治療的潛在靶點,對CK2α抑制劑的研究和應(yīng)用對NSCLC的治療具有深遠(yuǎn)的臨床意義。
【圖文】：

第 1 章 綜述起 DNA 損傷并且干擾 DNA 修復(fù)（如圖 1.1）[85]。而對于晚期 NSCLC 患者要化療誘導(dǎo)/輔助治療的早、中期 NSCLC 患者，CDDP 是最為有效的鉑劑[8.6.3.2 CDDP 在 NSCLC 化學(xué)藥物治療中的耐藥機(jī)制以 CDDP 為基礎(chǔ)的化療在 NSCLC 的治療過程中，隨著治療的進(jìn)展，CD藥物療效逐漸下降，在一項關(guān)于CDDP在NSCLC新輔助化療中療效的實驗完全反應(yīng)率只有大約 10%[87]，這反映了從一開始或后期獲得的對 CDDP 化耐藥，而 CDDP 在 NSCLC 治療中的耐藥現(xiàn)象正是改善患者長期療效的最主礙之一[88]。

圖 1.2 CDDP 的主要耐藥機(jī)制[90]Figure 1.2 Major mechanisms of tumour resistance to CDDPCisplatin enters cells either by transporters, such as the copper transporter CTR1, by passive diffusion. A loss of CTR1 results in less platinum entering the cells antherefore, in resistance. Enzymatic inactivation of cisplatin by metallothioneins anglutathione-related metabolism enzymes, such as glutathione transferase, have alsbeen described in some platinum-resistant cancer cells.DNA 修復(fù)路徑主要包含 4 條：核苷酸切除修復(fù)（nucleotide-excision repair，NER）、堿基切除修復(fù)（base-excision repair，BER）、錯配修復(fù)（mismatch repairMMR）和雙鏈斷裂修復(fù)（double-strand-break repair，DSBR）。乳腺癌 1 號（breacancer 1，BRCA1）可通過 NER 或是 DSBR 參與 DNA 修復(fù)或通過調(diào)控其他修復(fù)因子的表達(dá)水平從而介導(dǎo) DNA 損傷修復(fù)。有文獻(xiàn)報道，，CDDP 耐藥的 NSCL細(xì)胞株中，BRCA1 蛋白水平升高，而通過抑制 BRCA1 的表達(dá)，NSCLC 細(xì)胞對
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 Dana Loomis;Wei Huang;Guosheng Che;;The International Agency for Research on Cancer(IARC) evaluation of the carcinogenicity of outdoor air pollution:focus on China[J];Chinese Journal of Cancer;2014年04期

本文編號：2669732