【摘要】：甘露聚糖結(jié)合凝集素(Mannan-binding lectin,MBL)是一種可溶性的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor,PRR),為C型凝集素超家族中膠凝素(collectins)的一員。MBL主要由肝細(xì)胞合成,作為糖蛋白存在于血漿中。MBL在天然免疫及免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。近來(lái)的臨床資料表明MBL表達(dá)水平及其編碼基因(MBL2)的多態(tài)性與多種肝臟疾病密切相關(guān),如急性肝衰竭、乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、肝癌等。但是MBL在這些疾病中的具體作用機(jī)制尚不清楚。在本文研究中,我們選用了 MBL基因敲除小鼠(MBL-I-),探討MBL在肝細(xì)胞肝癌、四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷中的作用及機(jī)制,對(duì)相關(guān)疾病的治療研究具有一定的指導(dǎo)意義。第一章甘露聚糖結(jié)合凝集素在肝細(xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用研究目的:研究MBL在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用,并探討其作用機(jī)制。方法:采用高壓尾靜脈注射Hepal-6肝癌細(xì)胞的方法分別在MBL-/-小鼠及相應(yīng)的野生型(WT)小鼠中建立肝癌模型,21天后處死小鼠,觀察肝臟內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)的情況;體外用MBL處理肝癌細(xì)胞,CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力,流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移;分離小鼠肝臟白細(xì)胞,流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)肝臟內(nèi)骨髓來(lái)源的抑制性細(xì)胞(MDSCs)、調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Tregs)和CD8+IFN-γ+T的比例;進(jìn)一步利用免疫組化確認(rèn)肝臟腫瘤內(nèi)MDSCs的分布情況;用免疫熒光法檢測(cè)MBL2與MDSCs、MBL2與肝星狀細(xì)胞(HSCs)的共定位情況;使用免疫組化、Western blot、RT-PCR檢測(cè)HSCs的活化;ELISA檢測(cè)肝臟腫瘤組織研磨液中前列腺素E2(PGE2)的含量,并進(jìn)一步利用免疫熒光法探索產(chǎn)生PGE2的主要細(xì)胞;并用免疫組化、Western blot、RT-PCR檢測(cè)肝臟腫瘤內(nèi)環(huán)氧合酶2(COX2)的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)情況,同樣用免疫熒光驗(yàn)證表達(dá)COX2的主要細(xì)胞。最后將pAAV-MBL2通過(guò)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi),3周后注射肝癌細(xì)胞建立肝癌模型,成模后檢測(cè)上述指標(biāo),進(jìn)一步驗(yàn)證MBL在肝細(xì)胞肝癌中的作用。20%的HeG2-CM刺激LX2細(xì)胞,加入MBL處理,WB和RT-PCR的結(jié)果檢測(cè)LX2細(xì)胞上α-SMA和COX2的表達(dá),ELISA檢測(cè)LX2細(xì)胞培養(yǎng)上清中PGE2的含量。結(jié)果:I.MBL缺陷能促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展。2.MBL處理不直接影響肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移。3.MBL缺陷影響腫瘤微環(huán)境中MDSCs、Tregs和CD8+IFN-γ+T的比例。4.MBL缺陷影響aHSCs上COX2-PGE2軸。5.注射pAAV-MBL2后,MBL-/-小鼠中肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展明顯受到抑制。6.MBL抑制人肝星狀細(xì)胞系LX2細(xì)胞的活化。結(jié)論:在肝臟腫瘤微環(huán)境中,MBL主要通過(guò)影響aHSCs上COX2-PGE2軸,從而影響肝癌腫瘤微環(huán)境。這些結(jié)果提示MBL影響肝癌腫瘤微環(huán)境的機(jī)制,為MBL缺陷肝細(xì)胞肝癌患者的免疫治療,提供了新的切入點(diǎn)。第二章 甘露聚糖結(jié)合凝集素在四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷發(fā)生發(fā)展中的作用研究目的:研究MBL在四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷發(fā)生發(fā)展中的作用及其作用機(jī)制。方法:采用腹腔注射CCl(1 ul/g體重)的方法分別在MBL-/-小鼠及相應(yīng)的野生型(WT)小鼠中建立急性肝損傷模型,24h處死小鼠,收集小鼠血清及分離小鼠肝臟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。ELISA檢測(cè)小鼠血清中ALT、LDH的活性和炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β的水平;分離小鼠肝組織,HE染色觀察肝組織病變,TUNEL染色分析肝細(xì)胞壞死情況,RT-PCR檢測(cè)肝臟炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β的水平;WB及RT-PCR檢測(cè)CYP2E1的轉(zhuǎn)錄及表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)及免疫組化分析肝臟中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況;用抗Ly6G抗體中和中性粒細(xì)胞后,觀察肝損傷情況;RT-PCR研究趨化因子CXCL1、CXCL2的變化,并用WB、RT-PCR及免疫熒光法檢測(cè)肝臟巨噬細(xì)胞上CXCL2的表達(dá)情況。用氯磷酸鹽脂質(zhì)體清除巨噬細(xì)胞后,觀察肝損傷情況。最后將pAAV-MBL2通過(guò)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi),3周后建立急性肝損傷模型,進(jìn)一步驗(yàn)證MBL在急性肝損傷中的作用。結(jié)果:I.MBL缺陷加劇CC14誘導(dǎo)的肝損傷。2.MBL缺陷加劇CC14誘導(dǎo)的肝損傷并非由CC14的代謝所引起。3.MBL缺陷加劇CCl4誘導(dǎo)的肝損傷主要是由于中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增多。4.中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增多主要是通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞上CXCL2的表達(dá)。5.MBL缺陷加劇CC14誘導(dǎo)的肝損傷的機(jī)制是由巨噬細(xì)胞介導(dǎo)。6.注射pAAV-MBL2后,MBL-/-小鼠肝損傷明顯改善。結(jié)論:MBL主要通過(guò)影響巨噬細(xì)胞的功能,抑制其產(chǎn)生趨化因子,減弱中性粒細(xì)胞向肝臟的浸潤(rùn),從而改善肝損傷。這些結(jié)果揭示了 MBL在肝損傷發(fā)生中的免疫作用,這對(duì)相關(guān)疾病的治療具有一定的指導(dǎo)意義。
【圖文】：

逑刺激４８邋ｈ后ａＨＳＣｓ蛋白，以肝組織蛋白作為對(duì)照，檢測(cè)ＨＳＣ上是否有ＭＢＬ２逡逑的表達(dá)。結(jié)果顯示，不管ｑＨＳＣｓ，還是ａＨＳＣｓ均無(wú)ＭＢＬ２蛋白的表達(dá)（圖１－５Ｃ）。逡逑而且ｑＨＳＣｓ、ａＨＳＣｓ上均無(wú)ＭＢＬ２基因的轉(zhuǎn)錄（圖１－５Ｄ）。以上結(jié)果表明肝星逡逑狀細(xì)胞不能產(chǎn)生ＭＢＬ，但可與ＭＢＬ直接接觸從而發(fā)揮作用。逡逑首先我們檢測(cè)了腫瘤負(fù)荷小鼠肝臟中ＨＳＣｓ的活化，免疫組化、ＲＴ－ＰＣＲ和逡逑ＷＢ結(jié)果均顯示，ＭＢｌ／ｖｊ、鼠肝臟腫瘤中ａ－ＳＭＡ的表達(dá)明顯高于ＷＴ小鼠（圖逡逑１－６Ａ－Ｄ）。既然己經(jīng)確定ＭＢＬ可能通過(guò)ＨＳＣｓ影口向ＭＤＳＣｓ的浸潤(rùn)，那是如何逡逑影響的呢。在肝癌中，ａＨＳＣｓ可以產(chǎn)生粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、逡逑粒細(xì)胞刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、白介素－６邋（ＩＬ－６）、血小板源性生長(zhǎng)因子（ＰＤＧＦ）逡逑誘導(dǎo)ＭＤＳＣｓ，但己有研究指出這些并非是誘導(dǎo)ＭＤＳＣｓ的主要因子｜４１，４２】。Ｙａｐｉｎｇ逡逑Ｘｕ等的研究表明，ａＨＳＣｓ產(chǎn)生的ＰＧＥ２可以誘導(dǎo)ＭＤＳＣｓ，主要是通過(guò)合成ＰＧＥ２逡逑的限速酶ＣＯＸ２１４３１。通過(guò)ＥＬＩＳＡ方法

？邐？邐？邐＾邐＇邋Ｉ邋■逡逑＇Ｎ．．．邋．．．逡逑圖２－４使用抗Ｌｙ６Ｇ抗體中和小鼠肝臟中性粒細(xì)胞逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－４邋Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｄ邋ｉｎ邋ｖｉｖｏ邋ｂｙ邋ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ邋ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｎｔｉ－Ｌｙ６Ｇ逡逑Ａｂ逡逑（Ａ）邋Ｔｏ邋ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ邋ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ，邋ｍｉｃｅ邋ｗｅｒｅ邋ｒｅｃｅｉｖｅｄ邋ａｎ邋ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ邋ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋１００邋ｊｉｇ邋ａｎｔｉ－Ｌｙ６Ｇ逡逑Ａｂ邋ｏｒ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋Ａｂ，，邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，邋６邋ｈ邋ａｆｔｅｒ邋ＣＣＩ４邋ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ．邋（Ｂ）邋Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ逡逑Ｌｙ６Ｇ邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｅｌｌｓ邋ｏｆ邋ｌｉｖｅｒｓ邋ａｆｔｅｒ邋ａｎｔｉ－Ｌｙ６Ｇ邋Ａｂ邋ｏｒ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋Ａｂ邋ｔｒｅａｔｅｄ．Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒｓ，邋５０邋ｊｉｍ．逡逑５０逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7;R575

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本文編號(hào)：2669650