【摘要】：研究背景腎母細(xì)胞瘤(Wilms' Tumor,WT)是最常見的兒童泌尿系惡性實體腫瘤,WT約占兒童腫瘤的6%,在小于15歲的兒童及青少年中的發(fā)病率為0.1‰。microRNAs(miRNAs)是長約18-25nt的非編碼RNA,這些小RNA幾乎可以涉及整個生命活動,其對細(xì)胞的增殖分化、周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡及自噬的調(diào)控作用受到越來越多的關(guān)注。目前已經(jīng)證實參與蛋白處理的miRNA突變在腎母細(xì)胞瘤發(fā)病過程中起到關(guān)鍵作用。microRNA-145(miR-145)為miRNA家族中的重要成員,其在多種腫瘤,如胃癌、結(jié)直腸癌、食管癌、乳腺癌及前列腺癌等中呈低表達(dá)。研究認(rèn)為miR-145作為一種抑癌基因在肝內(nèi)膽管癌、膀胱癌等多種腫瘤中可以通過PI3K/Akt信號通路影響腫瘤細(xì)胞的各種生物學(xué)行為,包括細(xì)胞的生長、侵襲遷移能力,但其在WT中的作用仍不清楚。該研究旨在探討miR-145在腎母細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系,過表達(dá)miR-145后對腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路的調(diào)控作用,進(jìn)而影響腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、凋亡、自噬及遷移能力。材料和方法收集32例腎母細(xì)胞瘤患者的腫瘤組織及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本,利用qRT-PCR檢測腫瘤組織及癌旁正常組織中miR-145的相對表達(dá)量。在體外培養(yǎng)腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞,qRT-PCR檢測SK-NEP-1細(xì)胞中miR-145的表達(dá)水平,與人腎胚上皮細(xì)胞(293T)相比較。通過miR-145慢病毒載體過表達(dá)腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞中miR-145的表達(dá)水平,將其分為空白對照組、空載病毒轉(zhuǎn)染組、miR-145過表達(dá)組及miR-145+Akt-stimulate(Akt-s)組。利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中熒光蛋白的表達(dá)情況,通過qRT-PCR檢測過表達(dá)腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞后miR-145的表達(dá)水平。利用CCK-8細(xì)胞增殖實驗觀察miR-145對腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞增殖的抑制作用。流式細(xì)胞技術(shù)檢測腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞過表達(dá)miR-145后早期凋亡比例的變化。AO/EB熒光染色檢測細(xì)胞死亡情況。Transwell實驗檢測miR-145對腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞遷移能力的影響。Western blotting檢測過表達(dá)miR-145后PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白(PI3K,Akt及p-Akt)的表達(dá)水平,檢測過表達(dá)miR-145后凋亡相關(guān)蛋白(Bax,Bcl-2,caspase)的變化,檢測過表達(dá)miR-145后自噬相關(guān)蛋白(p62,LC3B及Beclinl)表達(dá)水平變化。結(jié)果一、miR-145在腎母細(xì)胞瘤臨床標(biāo)本中表達(dá)水平的研究與相應(yīng)的癌旁正常組織(相對表達(dá)量為22.75±3.78)相比,腎母細(xì)胞瘤組織(相對表達(dá)量為3.41±1.56)中的miR-145水平顯著減低,兩者表達(dá)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。miR-145表達(dá)水平與臨床分期有明顯相關(guān)性,臨床Ⅰ期患兒的腫瘤標(biāo)本中miR-145表達(dá)水平高于臨床Ⅱ、Ⅲ期的患兒,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。二、miR-145在腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平及其對Akt信號通路的調(diào)控轉(zhuǎn)染miR-145慢病毒前,檢測miR-145在人腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞中的相對表達(dá)量為(2.15±0.02),明顯低于人腎胚上皮細(xì)胞(293T)的相對表達(dá)量(57.23±1.78),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。熒光檢測及qRT-PCR驗證miR-145過表達(dá)組的相對表達(dá)量(1.17±0.07)較空白對照組中miR-145的相對表達(dá)量(12.6±0.24)增高。Western blotting結(jié)果顯示在腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞中信號通路相關(guān)蛋白PI3K及p-Akt蛋白水平減低,提示PI3K/Akt信號通路受到抑制。三、miR-145對腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控1.CCK-8細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示,miR-145過表達(dá)組細(xì)胞的增殖速度較空白對照組及空載病毒轉(zhuǎn)染組減慢,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Western blotting結(jié)果顯示,miR-145過表達(dá)組中Ki67蛋白表達(dá)水平較空白對照組、空載病毒轉(zhuǎn)染組減低。2.流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示,miR-145過表達(dá)組細(xì)胞的凋亡率(1.87±0.06)較空白對照組凋亡率(0.17±0.04)增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。AO/EB熒光染色結(jié)果顯示,miR-145過表達(dá)組細(xì)胞的死亡比例(19.36±3.14)%較空白對照組(4.69±4.79)%增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Western blotting結(jié)果顯示miR-145過表達(dá)后,自噬相關(guān)蛋白p62的表達(dá)減低、LC3B及Beclinl的表達(dá)水平增加,凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達(dá)及Bax/Bcl-2的比值增加。3.Tanswell遷移實驗結(jié)果顯示,miR-145過表達(dá)組較空白對照組及空載病毒轉(zhuǎn)染組的遷移能力減低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。四、Akt激活劑在miR-145對腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞生物學(xué)行為調(diào)控中的作用在 CCK-8、AO/EB 熒光染色、Western blotting、Transwell 遷移實驗中,Akt激活劑(2μg/ml)可以部分恢復(fù)miR-145對腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞的抑制作用。結(jié)論miR-145在腎母細(xì)胞瘤腫瘤組織中表達(dá)下調(diào),且與患兒臨床分期相關(guān)。上調(diào)miR-145表達(dá)水平可以抑制PI3K/Akt信號通路,進(jìn)而抑制腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞的增殖、遷移,同時上調(diào)了腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞的自噬和凋亡水平,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡,發(fā)揮了抑癌基因的作用。
【圖文】：

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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.11

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本文編號：2669187