【摘要】：噬菌體展示技術(shù)是一種功能強(qiáng)大的分子文庫展示技術(shù),可針對(duì)特定的靶標(biāo)有效地篩選出特異性的多肽或蛋白分子。由于多肽分子具有分子量小、易合成修飾、生物免疫原性低等優(yōu)點(diǎn),因此多肽作為一種生物識(shí)別分子被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。常見的生物識(shí)別分子,如抗體雖然親和力高、特異性好,但分子量大、提取方法復(fù)雜,核酸適體雖然靈活性高,但其二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)合效果易受周圍環(huán)境的影響,因此多肽作為生物識(shí)別分子具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。目前腫瘤相關(guān)問題是人們關(guān)注的熱點(diǎn),腫瘤標(biāo)志物作為一種與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)的生物標(biāo)志物,常用于腫瘤的診斷、監(jiān)測(cè)和預(yù)后,因此以腫瘤標(biāo)志物為靶標(biāo)篩選出特異性的多肽識(shí)別分子具有重要意義。傳統(tǒng)的噬菌體展示技術(shù)主要是將靶標(biāo)固定在固相載體上,經(jīng)過多輪淘選以獲得具有結(jié)合能力的噬菌體克隆,雖然該技術(shù)能有效地篩選出具有特異性親和能力的多肽,但是篩選過程中存在文庫易偏向性擴(kuò)增、易交叉污染、單克隆的挑取和驗(yàn)證步驟繁瑣等問題,因此如何發(fā)展出快速、高效、簡單的篩選新方法是目前噬菌體展示技術(shù)亟待解決的一個(gè)重要問題。本論文以發(fā)展噬菌體展示技術(shù)新方法及其應(yīng)用為研究目標(biāo),結(jié)合微流控技術(shù),建立快速、高效、高通量、自動(dòng)化的噬菌體展示技術(shù)新平臺(tái)。本工作主要展開了以下兩個(gè)工作:(1)利用傳統(tǒng)的噬菌體展示技術(shù)以腫瘤標(biāo)志物為靶標(biāo)進(jìn)行篩選,并篩選得到了對(duì)應(yīng)的特異性結(jié)合多肽。分別針對(duì)蛋白CD71和c-Met篩選得到了具有特異性的識(shí)別多肽,并模擬了其二級(jí)結(jié)構(gòu),為了考察這些多肽分子的結(jié)合能力,對(duì)其結(jié)合能力、特異性以及對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別能力進(jìn)行了分析。(2)結(jié)合微流控芯片試劑消耗量少、通量高、易集成等優(yōu)勢(shì),建立了基于液滴微流控噬菌體展示技術(shù)新方法。根據(jù)微流控相關(guān)理論,設(shè)計(jì)了一種具有螺旋結(jié)構(gòu)的雙入口十字交叉芯片,用于液滴的生成。以CD71為靶標(biāo),先在芯片外對(duì)噬菌體文庫進(jìn)行預(yù)富集,再對(duì)預(yù)富集的文庫實(shí)現(xiàn)芯片上的篩選。利用微流控液滴生成技術(shù),將單個(gè)分散的噬菌體和包被了靶標(biāo)的微球一起包裹到微液滴中,利用液滴中的宿主菌對(duì)噬菌體進(jìn)行大量擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大,當(dāng)融合噬菌體與靶標(biāo)具有結(jié)合能力時(shí)噬菌體可以結(jié)合到微球表面,最后破乳收集微球并對(duì)噬菌體核酸染色,熒光顯微鏡下挑取微球直接獲得具有結(jié)合能力的單克隆。通過該方法最后獲得了具有特異性結(jié)合能力的多肽,并進(jìn)一步對(duì)這些多肽的結(jié)合能力進(jìn)行了分析考察。這種篩選新方法具有液滴生成快速、通量高、試劑消耗少的優(yōu)點(diǎn),還降低了交叉污染的風(fēng)險(xiǎn),提高了篩選效率。
【圖文】：

蛋白質(zhì)外殼和環(huán)狀申鏈ＤＮＡ組成，全基因組共有１１個(gè)基因，其中５個(gè)基因編逡逑碼衣殼蛋白，分別是ｐ３、ｐ６、ｐ７、ｐ８和ｐ９蛋白，基于這些衣殼蛋白位點(diǎn)可以構(gòu)逡逑建多種外源多肽或蛋白展示的方法［３３］，如

圖１．３噬菌體介導(dǎo)的裸眼定量檢測(cè)［４３］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．３邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｏｆ邋ｐｈａｇｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ｃｏｕｎｔｉｎｇ邋ｓｔｒａｔｅｇｙ邋ｂｙ邋ｎａｋｅ邋ｅｙｅ［４３］逡逑噬菌體的尺寸在納米級(jí)別，而且形狀大小均一，使其在一些基于材料的牛物逡逑傳感器方面也有較好的應(yīng)川。Ｓｃｕｎｇ－Ｗｕｋ邋Ｌｅｅ課題組［４４］從火雞皮膚顏色的變化獲逡逑得靈感，模擬火雞皮膚內(nèi)膠原束納米結(jié)構(gòu)，發(fā)展了基于噬菌體自組裝［４５］的納米逡逑結(jié)構(gòu)牛物傳感器，該傳感器可以檢測(cè)濕度變化和揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)，并進(jìn)一步利；］］逡逑噬菌體可展示外多肽的性質(zhì)實(shí)現(xiàn)了邋ＴＮＴ等分子的靈敏檢測(cè)。通過在噬菌體衣殼逡逑蛋白融合表達(dá)ＴＮＴ特異性結(jié)合多肽，使噬菌體納米傳感器可以特異性識(shí)別ＴＮＴ，，逡逑ＴＮＴ與噬菌體表面多肽的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致噬菌體納米束的迅速膨脹或收縮，由于光逡逑的相干散射原理，傳感器發(fā)生明顯的顏色變化，由此輕松實(shí)現(xiàn)靶分子的快速靈敏逡逑檢測(cè)。這種基于噬菌體展示的牛物傳感器能特異性識(shí)別Ｋ分ＴＮＴ和它的類似物，逡逑檢測(cè)靈敏度低至３００邋ｐｐｂ．的ＴＮＴ，具有高靈敏度和高特異性識(shí)別能力，這種快速、逡逑
【學(xué)位授予單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R730.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Xiaohua Guo;Chuncheng Niu;Yunhua Wu;Xiaosheng Liang;;Application of an M13 bacteriophage displaying tyrosine on the surface for detection of Fe~(3+) and Fe~(2+) ions[J];Virologica Sinica;2015年06期

本文編號(hào)：2668697