【摘要】：背景:在全世界范圍內(nèi),癌癥是一個(gè)比較突出公共衛(wèi)生問(wèn)題,我國(guó)主要的惡性腫瘤主要是甲狀腺癌、胃癌、肺癌等其他十余種癌癥類疾病,在全部新發(fā)病例中約占75%。其中最常見(jiàn)的內(nèi)分泌惡性腫瘤是甲狀腺癌,每年發(fā)病率都在不斷的增長(zhǎng)。甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制尚沒(méi)有完全闡明,例如碘的攝入、遺傳因素、放射線接觸、其他如性激素等都可能與甲狀腺癌的發(fā)生有關(guān),已經(jīng)嚴(yán)重影響到了人類健康安全,特別是對(duì)于女性來(lái)說(shuō),越來(lái)越成為影響健康的惡性腫瘤類疾病,能夠?qū)ふ业讲⒉扇》e極正確而有效的治療方案已成為當(dāng)務(wù)之急。甲狀腺癌有四種組織學(xué)類型,乳頭狀甲狀腺癌和濾泡性甲狀腺癌為分化型甲狀腺癌,約占甲狀腺惡性腫瘤90%以上。分化型甲狀腺癌一般可以治愈的,較為常見(jiàn)。未分化甲狀腺癌惡性程度最高,且死亡率極高。因此,對(duì)于甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入的探討和研究,有助于我們能夠?qū)τ诩谞钕侔┻M(jìn)行更早的診斷,以及根據(jù)發(fā)病機(jī)制而開(kāi)發(fā)的更加全面而有效的治療新方案,從而以期進(jìn)一步改善甲狀腺癌患者的生活質(zhì)量,最終達(dá)到較穩(wěn)定和優(yōu)良的預(yù)后隨訪結(jié)果,降低甲狀腺癌類疾病的死亡率。對(duì)于大多數(shù)腫瘤來(lái)說(shuō)基因的突變對(duì)于腫瘤的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要,基因與腫瘤的關(guān)系是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)部的相關(guān)分子信號(hào)通路對(duì)于細(xì)胞產(chǎn)生作用,影響功能蛋白分子發(fā)生改變,使得細(xì)胞的增殖發(fā)生變化,細(xì)胞的生物學(xué)特性及形態(tài)學(xué)改變,最終產(chǎn)生腫瘤。研究表明mi R-21參與多種腫瘤的發(fā)生和生長(zhǎng)。抑癌基因磷酸酶與張力蛋白同源物基因(PTEN)通過(guò)Akt去磷酸化抑制腫瘤,而PTEN是mi R-21的靶基因。許多學(xué)者進(jìn)行的現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明,天然藥物苦參堿具有常見(jiàn)的抗病毒、抗炎、抗心律失常等作用,同時(shí)具有很強(qiáng)的抑制腫瘤發(fā)生的作用,研究表明苦參堿可抑制腫瘤細(xì)胞的增生,臨床上苦參堿對(duì)肝癌、胃癌以及白血病都有良好的臨床治療效果,同時(shí)苦參堿成分的毒副作用弱,故經(jīng)過(guò)研究,在未來(lái)很有可能應(yīng)用其抗癌的良好作用,制成具有很好抗癌效果的植物活性藥物,可能是治療人甲狀腺癌乳頭狀細(xì)胞(Thyroid papillary carcinoma-1,TPC-1)的一種有前景的替代藥物。甲狀腺未分化癌(Anaplastic thyroid carcinoma,ATC)靶向治療最有效的藥物類別是紫杉醇(紫杉醇或多西紫杉醇)、蒽醌類、苯醌類和鉑類(順鉑或卡鉑)。天然產(chǎn)品苯醌類化合物--四氟對(duì)苯醌具有很好的抗腫瘤活性和毒性很低。作用機(jī)制涉及醌氧自由基的產(chǎn)生,參與重要的細(xì)胞過(guò)程的分子的甲基化、DNA等作用。目的:本研究旨在探討苦參堿對(duì)TPC-1細(xì)胞的治療作用及潛在分子機(jī)制。研究苦參堿對(duì)體外培養(yǎng)的TPC-1細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響,以及苦參堿對(duì)TPC-1細(xì)胞中mi R-21和靶基因PTEN/Akt通路表達(dá)的影響。探討四氟對(duì)苯醌在體內(nèi)和體外對(duì)ATC影響。為苦參堿和四氟對(duì)苯醌治療甲狀腺癌進(jìn)一步研究,提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)和理論基礎(chǔ),探索苦參堿和四氟對(duì)苯醌治療甲狀腺癌的應(yīng)用前景,為治療甲狀腺癌的藥物開(kāi)發(fā)提供新的研究思路。方法:(1)MTT法檢測(cè)苦參堿對(duì)TPC-1細(xì)胞生存率的影響。(2)q RT-PCR檢測(cè)苦參堿作用TPC-1細(xì)胞,micro RNA-21基因表達(dá)變化。(3)分別轉(zhuǎn)染micro RNA-21 mimics質(zhì)粒和micro RNA-21 inhibitor質(zhì)粒,Annexin V-PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化;(4)Western blot方法檢測(cè)線粒體凋亡相關(guān)蛋白PTEN蛋白、Akt蛋白的變化。(5)用MTT法分析了HOTHC和ATC細(xì)胞系的生長(zhǎng)情況。(6)Western blot對(duì)蛋白帶進(jìn)行定量及DAPI染色細(xì)胞的核分裂分析。(7)分析HOTHC細(xì)胞的小管形成趨勢(shì)及測(cè)定HOTHC細(xì)胞遷移。(8)裸鼠模型實(shí)驗(yàn)測(cè)定腫瘤體積和重量,以測(cè)定腫瘤生長(zhǎng)抑制率。結(jié)果:(1)MTT法測(cè)定苦參堿在濃度和時(shí)間上抑制TPC-1細(xì)胞的生長(zhǎng),最高可達(dá)95.8%(20 mg/ml的苦參堿),其IC50為3.54 mg/ml,48 h。(2)用FITC-A/PI雙染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TPC-1甲狀腺癌細(xì)胞凋亡。苦參堿誘導(dǎo)TPC-1細(xì)胞凋亡顯著。發(fā)現(xiàn)M0對(duì)照組在G1期51.36±2.07%,在S期23.37±3.25%和G2/M期18.49±2.46%。與苦參堿TPC-1細(xì)胞治療后10 mg/ml 48h,在G1期細(xì)胞比例增加到74.49±3.65%,在S期下降到2.42±1.63%。在G2/M相中,未觀察到細(xì)胞百分比的顯著變化。這些結(jié)果表明,在甲狀腺癌細(xì)胞的G1/S期,苦參堿誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。(3)mi R-21的水平是由實(shí)時(shí)qPCR測(cè)定,TPC-1細(xì)胞用苦參堿0、2、5mg/ml(M0,M2和M5)處理后48 h�？鄥A處理的TPC-1細(xì)胞,mi R-21明顯降低。PTEN結(jié)果上調(diào)M5/M0增加到1.66倍,M2/M0增加到1.21倍。Akt水平降低M5/M0為0.34倍和M2/M0為0.61倍。實(shí)驗(yàn)表明,使用苦參堿治療的TPC-1細(xì)胞的mi R-21水平被下調(diào),隨后,其目標(biāo)PTEN在m RNA和蛋白水平均升高,Akt水平降低。另一方面,mi R-21模擬序列被轉(zhuǎn)染到TPC-1細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)mi R-21的過(guò)度表達(dá)下調(diào)了PTEN蛋白水平。這些結(jié)果表明,苦參堿可以調(diào)節(jié)mi R-21來(lái)改善PTEN抑制TPC-1甲狀腺癌細(xì)胞。(4)Western blotting檢測(cè)PTEN蛋白和磷酸化Akt(p Akt)蛋白水平。與M0對(duì)照相比,PTEN在苦參堿上顯著上調(diào)(M5/M0 1.64倍,M2/M0 1.21倍)。p Akt的水平被下調(diào)(M2/M0為0.61倍,M5/M0為0.24倍)。mi R-21 mimic顯著降低了PTEN蛋白(與M0 blot的比值),并將p Akt增加到1.24倍(比M0 blot值)。這些結(jié)果闡明了苦參堿調(diào)控mi R-21/PTEN/Akt通路誘導(dǎo)TPC-1細(xì)胞凋亡和周期阻滯。(5)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在四氟對(duì)苯醌治療48小時(shí)內(nèi),HOTHC和ATC細(xì)胞系的生長(zhǎng)顯著下降。使細(xì)胞的生長(zhǎng)從98%減少到17%,細(xì)胞生長(zhǎng)速率分別為96%和21%。(6)HOTHC細(xì)胞凋亡。Western blot分析顯示在HOTHC細(xì)胞系中Bcl-2的表達(dá)明顯減少。DAPI染色結(jié)果顯示,在四氟對(duì)苯醌治療HOTHC細(xì)胞中,DNA的分裂和核細(xì)胞凋亡的存在。(7)用四氟對(duì)苯醌對(duì)HOTHC細(xì)胞的治療后,導(dǎo)致了對(duì)低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的抑制。(8)在使用四氟對(duì)苯醌的治療中,HOTHC細(xì)胞的血管生成能力和遷移潛力均受到抑制。(9)四氟對(duì)苯醌治療在小鼠異種移植模型體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)。結(jié)論:(1)苦參堿抑制TPC-1人甲狀腺癌乳頭狀細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和周期阻滯;(2)苦參堿下調(diào)TPC-1人甲狀腺癌乳頭狀細(xì)胞中mi R-21表達(dá)量;誘導(dǎo)PTEN上調(diào),p Akt信號(hào)下調(diào);(3)mi R-21/PTEN/Akt通路可能是苦參堿抑制TPC-1甲狀腺癌細(xì)胞的機(jī)制之一。(4)在四氟對(duì)苯醌治療HOTHC和ATC細(xì)胞系的生長(zhǎng)顯著下降,B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)的表達(dá)明顯減少,Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和細(xì)胞凋亡的標(biāo)志蛋白PARP降解產(chǎn)物(cleaved-PARP)的表達(dá)細(xì)胞增加。(5)對(duì)HOTHC細(xì)胞的治療導(dǎo)致了對(duì)HIF-1和VEGF表達(dá)的抑制,HOTHC細(xì)胞的血管生成能力和遷移潛力均受到抑制。(6)四氟對(duì)苯醌治療裸鼠腫瘤體積和重量顯著下降。(7)苦參堿和四氟對(duì)苯醌可以成為治療甲狀腺癌的有效替代藥物。
【圖文】：

圖 1：MAPK 和 PI3K- Akt -MTR 通路在甲狀腺癌中的遺傳改變和治療靶點(diǎn)。右側(cè)顯示MAPK 信號(hào)通路，左側(cè)顯示 PI3K- Akt -mTOR 通路。MAPK 通路中的突變包括 RT-PTC重排、RAS 突變和 BRAF 突變。PI3K 通路中常見(jiàn)的遺傳改變包括 RAS 突變、PTEN 突變或缺失，PIK3CA 突變或擴(kuò)增，Akt1 突變[91]。在許多不同類型的腫瘤組織、移植瘤、腫瘤細(xì)胞系和多種進(jìn)展期腫瘤組織（ 如腦腫瘤、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、膀胱癌、甲狀腺癌及非小細(xì)胞肺癌）中存在著不同程度的突變或丟失的PTEN 基因；此種改變可作為脂質(zhì)磷酸酶，，負(fù)性調(diào)控 P13K-Akt 通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖和凋亡；也可作為蛋白磷酸脂酶，抑制 MAPK 信號(hào)通路[92]。PTEN 作為抑癌基因之一，其發(fā)生突變或者缺失導(dǎo)致PI3K-Akt 信號(hào)通路激活，在絕大多數(shù)的腫瘤發(fā)生過(guò)程中，扮演著重

第 2 章 苦參堿對(duì)分化型甲狀腺癌靶向治療應(yīng)用研究結(jié)果1 苦參堿對(duì) TPC-1 細(xì)胞增殖的影響MTT 法測(cè)定細(xì)胞在 0、1、2、5、10、20 mg/ml、24h、48h、7情況下，對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞 TPC-1 的生長(zhǎng)情況進(jìn)行測(cè)定。苦參堿 TPC-1 細(xì)胞在濃度和時(shí)間上的生長(zhǎng)，其 IC50 為 3.54 mg/ml, 48 1）。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R736.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2665945