【摘要】：涎腺腺樣囊性癌(Salivary Adenoid Cystic Carcinoma,SACC)臨床最常見的涎腺高發(fā)惡性腫瘤之一,具有嗜神經(jīng)侵襲和高血行轉(zhuǎn)移低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移這兩個(gè)顯著的臨床特點(diǎn),肺是最常見SACC血行轉(zhuǎn)移的靶器官。而其高血行轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和患者不良預(yù)后的重要原因,也是研究關(guān)注的焦點(diǎn)問題。腫瘤中血管的生成在腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移的過程中起到了至關(guān)重要的作用。腫瘤中的血管是腫瘤細(xì)胞所需營(yíng)養(yǎng)的輸送渠道,也是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要渠道,腫瘤中血管生成能力和微血管密度(micro vessels density,MVD)與腫瘤的血行轉(zhuǎn)移正相關(guān)。Neuropilin蛋白家族是一類與腫瘤血管/淋巴管生成密切相關(guān)的跨膜細(xì)胞受體,不僅參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為,其成員NRP1和NRP2分別參與調(diào)節(jié)腫瘤中血管或淋巴管的生成。但是,在SACC中,是否存在由于NRP1和NRP2表達(dá)差異而導(dǎo)致的血管淋巴管生成差異,進(jìn)而導(dǎo)致SACC出現(xiàn)高血行轉(zhuǎn)移低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的臨床特點(diǎn),未見報(bào)道。從2008年開始,普萘洛爾被發(fā)現(xiàn)具有抑制血管生成的作用,被用作臨床治療嬰幼兒血管瘤的一線藥物,具有安全性高,經(jīng)濟(jì)性好的特點(diǎn)。目前,也有少量有關(guān)普萘洛爾對(duì)某些腫瘤細(xì)胞作用的研究,提示,在體外,普萘洛爾可以抑制某些腫瘤細(xì)胞系,如胰腺癌等,細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡,但普萘洛爾對(duì)SACC是否具有上述效果未見報(bào)道。綜上所述,本課題源自涎腺腺樣囊性癌血行轉(zhuǎn)移率高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低這一臨床特點(diǎn),在正常涎腺組織(normal salivary gland,NSG)、口腔鱗狀細(xì)胞癌組織(oral squamous cell carcinoma,OSCC)、發(fā)生血行轉(zhuǎn)移SACC(metastatic SACC)以及未發(fā)生血行轉(zhuǎn)移SACC(non-metastatic SACC)中對(duì)比研究NRP1、NRP2及其配體VEGF-A等與血管生成相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá),微血管密度、微淋巴管密度(micro lymphatic vessels density,LVD)與蛋白表達(dá)和SACC血行轉(zhuǎn)移的關(guān)系;研究普萘洛爾對(duì)SACC細(xì)胞的抑制作用以及對(duì)血管生成相關(guān)因子表達(dá)的抑制作用,為臨床治療SACC血行轉(zhuǎn)移提供新的治療策略和實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。研究目的:1、研究NRP1、NRP2及其配體VEGF-A等蛋白在正常涎腺組織、口腔鱗狀細(xì)胞癌組織、發(fā)生血行轉(zhuǎn)移SACC以及未發(fā)生血行轉(zhuǎn)移SACC中的表達(dá)水平差異;研究上述組織中MVD和LVD的差異,并對(duì)NRP1及其配體VEGF-A等的表達(dá)強(qiáng)度與SACC組織和正常涎腺組織中MVD的關(guān)系進(jìn)行了相關(guān)性分析研究。2、利用人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞系SACC-83和人涎腺腺樣囊性癌肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞系SACC-LM,研究普萘洛爾對(duì)SACC細(xì)胞中NRP1、VEGF-A等血管生成相關(guān)因子和MMP-2以及MMP-9等與腫瘤細(xì)胞侵襲遷移運(yùn)動(dòng)相關(guān)因子的抑制作用;研究普萘洛爾對(duì)SACC細(xì)胞在遷移、侵襲等與轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞生物學(xué)行為的影響;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)研究普萘洛爾對(duì)SACC血行肺轉(zhuǎn)移的影響。3、研究普萘洛爾對(duì)SACC-83和SACC-LM這兩種SACC腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期和細(xì)胞自噬的影響;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)研究普萘洛爾對(duì)SACC腫瘤形成和增殖的影響及對(duì)腫瘤內(nèi)血管生成的影響。研究方法:1、收集正常涎腺組織、口腔鱗狀細(xì)胞癌組織、發(fā)生血行轉(zhuǎn)移SACC以及未發(fā)生血行轉(zhuǎn)移SACC組織標(biāo)本各30例,通過免疫組織化學(xué)染色和光密度法(mean IOD),觀察對(duì)比NRP1、NRP2及其配體VEGF-A、Sema-3A和Sema-3F等蛋白在不同組織間的表達(dá)水平的差異;利用血管和淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物,對(duì)上述組織中的MVD和LVD進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì);單因素方差分析用于研究不同組間蛋白表達(dá)的差異和組間MVD、LVD的差異;相關(guān)性檢驗(yàn)用于研究MVD與目標(biāo)蛋白表達(dá)之間的相互關(guān)系,綜合所得結(jié)果分析SACC高血行轉(zhuǎn)移可能的原因。2、對(duì)正常涎腺組織和SACC組織中β腎上腺素能受體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色分析,主要研究其在SACC組織中的分布情況。研究不同濃度的普萘洛爾作用于SACC-83和SACC-LM細(xì)胞后,通過western blot實(shí)驗(yàn)研究細(xì)胞中NRP1、VEGF-A、MMP-2和MMP-9等與血管生成和細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)的蛋白的表達(dá)變化;ELISA實(shí)驗(yàn)研究普萘洛爾對(duì)SACC腫瘤細(xì)胞分泌VEGF-A能力的影響;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)研究細(xì)胞遷移、侵襲能力的變化;利用人涎腺腺樣囊性癌肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞系SACC-LM建立裸鼠SACC肺轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型,研究普萘洛爾對(duì)SACC經(jīng)血行肺轉(zhuǎn)移的抑制作用。3、通過MTT實(shí)驗(yàn)研究普萘洛爾對(duì)SACC-83和SACC-LM細(xì)胞增殖能力的影響;流式細(xì)胞技術(shù)研究普萘洛爾對(duì)SACC-83和SACC-LM細(xì)胞凋亡和周期的影響;western blot實(shí)驗(yàn)觀察普萘洛爾作用后細(xì)胞中自噬標(biāo)志物的表達(dá)水平變化,研究普萘洛爾對(duì)細(xì)胞自噬的影響;利用SACC-LM細(xì)胞建立SACC裸鼠皮下移植瘤動(dòng)物模型,研究在體內(nèi)環(huán)境下普萘洛爾對(duì)SACC移植瘤形成及增殖的抑制作用,以及對(duì)腫瘤內(nèi)血管生成的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1、在NSG、SACC、OSCC組織中,NRP1的NRP2表達(dá)具有明顯差異:NRP1在SACC、OSCC在NSG中表達(dá)水平依次降低;NRP2在OSCC中表達(dá)最高,在NSG和SACC中無(wú)差別。MVD在SACC、OSCC和NSG中依次減少(p0.001)。OSCC中LVD最高,在NSG和SACC中LVD無(wú)差別。在轉(zhuǎn)移SACC、未轉(zhuǎn)移SACC和NSG中,NRP1、VEGF-A表達(dá)水平依次降低;NRP2的表達(dá)在三種組織間無(wú)差別;Sema-3A和Sema-3F的表達(dá)在三種組織間依次升高。MVD在轉(zhuǎn)移SACC、未轉(zhuǎn)移SACC和NSG中依次降低,組間差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;LVD在三種組織間無(wú)差別。NRP1和VEGF-A在SACC-LM中表達(dá)均較SACC-83升高;而NRP2在SACC-LM中表達(dá)較SACC-83沒有差別,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、普萘洛爾作用于SACC-83和SACC-LM細(xì)胞后,兩種細(xì)胞中的NRP1、VEGF-A、MMP-2和MMP-9表達(dá)隨藥物濃度的上升均下降,并且腫瘤細(xì)胞分泌VEGF-A的水平也有下降;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,SACC細(xì)胞的遷移和侵襲能力隨普萘洛爾濃度的升高而降低;裸鼠肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),普萘洛爾作用組中,SACC肺轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移灶少,且轉(zhuǎn)移灶的體積也較小,證明普萘洛爾可以抑制SACC細(xì)胞的經(jīng)血行肺轉(zhuǎn)移。3、普萘洛爾作用于SACC-83和SACC-LM細(xì)胞后,兩種細(xì)胞的增殖隨藥物濃度的上升和作用時(shí)間的延長(zhǎng)受到明顯的抑制;細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)普萘洛爾作用后,兩種細(xì)胞S期延長(zhǎng),G0/G1期縮短,符合增殖抑制的表現(xiàn)。普萘洛爾作用后均促進(jìn)了SACC-83和SACC-LM細(xì)胞的凋亡和自噬,作用效果與藥物濃度和作用時(shí)間正相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),普萘洛爾作用后,SACC移植瘤重量顯著小于對(duì)照組。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在移植瘤中,普萘洛爾作用組MVD雖然與對(duì)照組MVD沒有差別,但普萘洛爾作用組的血管直徑要明顯小于對(duì)照組,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:涎腺腺樣囊性癌中NRP1和VEGF-A的表達(dá)升高導(dǎo)致了血管生成的增加,為其血行轉(zhuǎn)移提供了必要條件;NRP2的低水平表達(dá)抑制了腫瘤中淋巴管的生成,阻斷了腫瘤沿淋巴管轉(zhuǎn)移的通道,降低了腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能。上述原因可能是導(dǎo)致涎腺腺樣囊性癌高血行轉(zhuǎn)移低淋巴轉(zhuǎn)移的原因之一。普萘洛爾可以通過抑制SACC細(xì)胞表面NRP1的表達(dá)以及腫瘤細(xì)胞中VEGF-A的合成與分泌,抑制SACC組織中新生血管的形成和發(fā)育,并通過抑制SACC細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá),抑制了腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力,同時(shí),普萘洛爾還具有停滯腫瘤細(xì)胞周期、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬,從而抑制細(xì)胞增殖的能力。綜上所述,對(duì)于SACC,普萘洛爾從腫瘤中血管生成和腫瘤增殖及運(yùn)動(dòng)等多方面抑制了SACC的發(fā)展和血行轉(zhuǎn)移。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2665817