【摘要】：原發(fā)性肝癌具有高死亡率和高發(fā)病率的特點(diǎn),嚴(yán)重威脅人類健康。多種因素可以誘導(dǎo)肝臟腫瘤的發(fā)生發(fā)展,近年來(lái)的研究表明多個(gè)基因參與肝臟腫瘤進(jìn)程,但是具體機(jī)制仍需不斷探索。研究報(bào)道肝臟合成的膽汁酸是一種重要的信號(hào)分子,適宜濃度的膽汁酸有利于脂類等物質(zhì)的消化吸收和肝臟再生及修復(fù);當(dāng)膽汁淤積時(shí),過(guò)高濃度的膽汁酸則會(huì)損傷肝細(xì)胞導(dǎo)致炎癥,甚至肝臟腫瘤的發(fā)生。膽汁酸受體Fxr(Farnesoid X Receptor,法尼醇受體)參與膽汁酸合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝,維持體內(nèi)膽汁酸平衡,防止高濃度膽汁酸造成的毒害作用。Fxr~(-/-)的小鼠自發(fā)生成腫瘤,隨后多項(xiàng)研究表明Fxr是一個(gè)腫瘤抑制因子。Dlk1(Delta-like 1,δ樣蛋白同系物1)作為一種印跡基因,與腫瘤生成密切相關(guān),已被證實(shí)它可以促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)展,并且有望成為早期肝臟腫瘤診斷標(biāo)志物。由于Fxr和Dlk1在肝臟腫瘤進(jìn)程中均扮演重要角色,本研究假設(shè)Fxr與Dlk1之間存在某種調(diào)控關(guān)系,并首次證實(shí)Dlk1是Fxr的下游基因,初步揭示了Fxr抑制Dlk1表達(dá)的分子機(jī)理。主要研究?jī)?nèi)容如下:1.激活Fxr抑制Dlk1表達(dá)使用Fxr特異性激動(dòng)劑GW4064分別處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSC和人肝臟腫瘤細(xì)胞Huh7 24 h,QRT-PCR檢測(cè)Fxr下游基因Bsep或Shp表達(dá)顯著升高,確定Fxr已激活;QRT-PCR和Western Blot檢測(cè)Dlk1表達(dá)顯著降低,這些結(jié)果表明激活Fxr抑制Dlk1表達(dá)。2.激活Fxr抑制Dlk1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性為了驗(yàn)證Fxr是否直接調(diào)控Dlk1表達(dá),我們構(gòu)建了包含預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的pGL3-Dlk1啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染Hep1-6細(xì)胞并使用Fxr特異性激動(dòng)劑GW4064處理24 h,雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示,GW4064顯著下調(diào)pGL3-Dlk1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。3.建立小鼠肝損傷模型在C57/BL小鼠的標(biāo)準(zhǔn)日糧中添加0.1%3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氫-2,4,6-三甲基吡啶(3,5-Diethoxycarbonyl-1,4-Dihydro-2,4,6-Collidine,DDC),飼喂小鼠7天以建立肝損傷模型。結(jié)果顯示血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Alanine Ami-notransferase,ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate Aminotransferase,AST)水平顯著升高;蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-Eosin Staining,HE)發(fā)現(xiàn)肝臟匯管區(qū)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),表明成功建立肝損傷模型。4.在小鼠肝損傷模型中,CDCA減輕DDC所致肝臟損傷在小鼠的標(biāo)準(zhǔn)日糧中添加0.1%DDC同時(shí)使用20 mg/kg鵝脫氧膽酸(Chenodeoxycholic Acid,CDCA)每天對(duì)其進(jìn)行灌胃處理,7天后采集肝臟組織。CDCA處理后,QRT-PCR檢測(cè)Bsep升高,Western Blot檢測(cè)Dlk1表達(dá)顯著下調(diào)。同時(shí)觀察到CDCA灌胃處理后,血清ALT、AST水平降低,HE染色結(jié)果也顯示CDCA組肝臟炎癥明顯減輕。這些結(jié)果表明CDCA通過(guò)激活Fxr抑制Dlk1表達(dá),可能是減輕DDC所致肝臟損傷的原因。
【圖文】：

DNA 結(jié)合域（DBD），鉸鏈區(qū)（Hinge Region）等（Wang et al 2008; Fausto et al 2012）（圖1-1）。DBD 區(qū)的鋅指結(jié)構(gòu)與 DNA 結(jié)合和二聚化有關(guān)；當(dāng)配體結(jié)合到 LBD 區(qū)域后，改變核受體原有的空間構(gòu)象，使之與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的 Fxr 反應(yīng)元件（FXRResponse Element, FXRE）結(jié)合，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄。人源 Fxr 位于染色體 12q23.1，包含 10 個(gè)內(nèi)含子和 11 個(gè)外顯子，共有 76997 個(gè)堿基。小鼠 Fxr 基因轉(zhuǎn)錄后可分為 4 個(gè)亞型：Fxr 1、Fxr 2、Fxrβ1 和 Fxrβ2（Zhang et al 2002; Cai et al 2007），4 個(gè)亞型組織分布并不相同，說(shuō)明它們的生理功能也許存在差異。最初的研究顯示 Fxr 僅表達(dá)于腎上腺、腎臟和肝腸系統(tǒng)（Forman et al 1995），后來(lái)研究人員運(yùn)用實(shí)時(shí) PCR 技術(shù)表明 Fxr 也表達(dá)于胃、肺、心和脂肪

膽汁酸核受體 Fxr 對(duì) Dlk1 表達(dá)影響及機(jī)制1.2.4 Fxr 與肝臟腫瘤膽汁酸濃度過(guò)高可促進(jìn)肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化（Perez and Briz 2009），膽汁酸受體Fxr 參與其合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝等過(guò)程，維持體內(nèi)膽汁酸穩(wěn)態(tài)。肝臟 Fxr 調(diào)控膽鹽輸出泵（Bile Salt Export Pump, Bsep）等膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的轉(zhuǎn)錄，參與膽汁酸肝腸循環(huán)（Soroka et al 2010; Lan et al 2012）。Fxr 還通過(guò)誘導(dǎo)小分子異源二聚體伴侶（Short Hetero Dimer Partner, Shp）基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控一系列下游通路基因以促進(jìn)膽汁酸排泄（Vanwijngaerden et al 2011; Seok et al 2013）。Fxr 調(diào)控多條信號(hào)通路以平衡體內(nèi)膽汁酸水平，，避免高濃度膽汁酸引起的毒害作用（Chiang2009）（圖 1-2）。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：2665686