【摘要】：研究背景:腫瘤是細胞分裂與細胞死亡失衡的一類疾病。在世界范圍內(nèi),肺癌已成為是腫瘤死亡的首要原因。而在我國城市人口中,肺癌患者的死亡已上升為占腫瘤死亡原因第一位~([1])。在確診肺癌的患者中只有16%生存期超過五年或以上。按照病理類型分類,肺癌中的85%以上為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)~([2])。目前,手術仍是非小細胞肺癌的首選的治療方法,然而對于不適合手術的晚期患者或需要進行術后治療的患者來說,化療仍是最主要的治療手段。雖然目前用于化療的藥物及治療方案多樣,也在一定程度上可以改善晚期肺癌的患者的預后,但由于不可避免的藥物毒性及逐漸出現(xiàn)的藥物耐藥,仍然使大多數(shù)患者最終仍然出現(xiàn)治療失敗的結(jié)果。腫瘤藥物的化學耐藥已經(jīng)成為是化學治療抗癌失敗的主要原因。因此,進一步延長NSCLC患者生存期,緩解腫瘤患者臨床癥狀成為了目前臨床治療的主要目的~([3,4])。吉西他濱與紫杉醇均為臨床上療效較佳的化療藥物。吉西他濱是核苷類藥物,其作用機理是通過殺傷S期腫瘤細胞,并且阻斷增殖細胞由G1向S期轉(zhuǎn)化進展~([5])。吉西他濱具有抑制DNA合成作用,從而殺傷腫瘤細胞;同時還可提高腫瘤細胞對其他藥物的敏感性。紫杉醇的作用機制主要是通過促進微管蛋白二聚體的組合并阻止其解聚而達到穩(wěn)定微管的作用,從而抑制了細胞有絲分裂期至關重要的微管的正常動態(tài)重組,將細胞周期阻斷于G2/M期,阻礙腫瘤細胞復制,使癌細胞無法繼續(xù)分裂而死亡。同時紫杉醇還有誘發(fā)癌細胞凋亡和調(diào)節(jié)人體機能的作用~([6])。然而,耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)導致以吉西他濱和紫杉醇這兩種藥物為主的治療不能取得較佳的臨床療效,致使肺癌治療的困難加大。Notch信號通路參與了細胞增殖、分化、凋亡、黏附及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程,其異�？赡軐е履[瘤生成~([7])。異�；罨腘otch通路可能通過其下游的蛋白調(diào)控著腫瘤細胞的增殖和侵襲~([8])。有研究表明,Notch通路的異常活化與卵巢癌耐藥性有關。Notch3活化的卵巢癌細胞對鉑依賴的化療藥物能產(chǎn)生耐藥性~([9])。我們既往研究也表明,Notch信號通路在非小細胞肺癌預后中存在作用~([10])。針對患者對吉西他濱和紫杉醇的耐藥性導致臨床效果不佳的問題,為探尋解決辦法,我們從Notch信號通路著手研究。探討該信號通路在吉西他濱和紫杉醇的耐藥中的作用,為非小細胞肺癌耐藥尋找新的治療方案。研究目的:(1)探討Notch信號通路在耐藥非小細胞肺癌治療中作用:檢測Notch信號通路阻斷劑GSI-IX干預后,紫杉醇和吉西他濱對H1299細胞和A549細胞克隆形成的影響。(2)檢測紫杉醇和吉西他濱耐藥細胞株中Notch3蛋白的表達情況和變化。分析Notch信號通路在肺癌耐藥中的作用。(3)研究比較對紫杉醇和吉西他濱對各自耐藥細胞株的生長抑制作用是否存在交叉敏感性。(4)分析Notch信號通路阻斷劑GSI-IX對耐藥肺癌細胞生長、增殖、凋亡的影響,從而探討GSI-IX能否通過激活凋亡途徑來誘導細胞凋亡,從而提高化療藥物紫杉醇和吉西他濱在耐藥細胞中的敏感性。實驗方法:(1)細胞培養(yǎng):本研究培養(yǎng)H1299和A549細胞,并分別用紫杉醇和吉西他濱誘導出相應的耐藥細胞株。(2)用Western blot方法分別檢測H1299和A549細胞及相應的紫杉醇和吉西他濱耐藥細胞中Notch3、Bcl-2和Bax蛋白表達情況。(3)采用MTT方法檢測GSI-IX單獨干預和協(xié)同紫杉醇、吉西他濱對相應的耐藥H1299和A549細胞增殖能力的影響。(4)流式細胞術檢測GSI-IX單獨作用和協(xié)同作用紫杉醇、吉西他濱對相應耐藥H1299和A549細胞凋亡作用的影響。結(jié)果:(1)分析比較GSI-IX、吉西他濱、紫杉醇單獨和聯(lián)合作用于H1299細胞和A549細胞后對細胞克隆數(shù)的影響。結(jié)果顯示:GSI-IX組的細胞克隆數(shù)減少,其作用與單純吉西他濱、單純紫杉醇作用比較,作用相當。并且GSI-IX聯(lián)合吉西他濱組對兩種細胞克隆數(shù)減少的影響作用最大。提示GSI-IX可以提高吉西他濱對腫瘤細胞的化療敏感性。(2)檢測吉西他濱和紫杉醇耐藥細胞株中的Notch3蛋白的表達情況顯示:耐藥細胞中的Notch3蛋白明顯比非耐藥細胞中的Notch3蛋白增加。比較GSI-IX加入4組耐藥細胞后Notch3蛋白表達水平與單獨的耐藥細胞株中的Notch3蛋白表達水平,前者較后者明顯減少。說明Notch3信號通路與腫瘤耐藥有關,可能參與了腫瘤耐藥的進程。(3)檢測吉西他濱和紫杉醇在對4組耐藥細胞的生長抑制作用。結(jié)果顯示吉西他濱作用于紫杉醇耐藥的2組細胞,其對細胞的生長抑制作用比作用于吉西他濱耐藥的2組細胞生長抑制作用強。同時紫杉醇對吉西他濱耐藥的2組細胞生長抑制作用強于紫杉醇耐藥的2組細胞。說明紫杉醇和吉西他濱不存在交叉耐藥現(xiàn)象,反而交叉使用可以提高化療敏感性。(4)檢測GSI-IX對4種耐藥細胞增殖力的影響。結(jié)果顯示,與空白對照組相比,GSI-IX組及GSI-IX聯(lián)合吉西他濱或紫杉醇組明顯抑制了細胞的增殖;與單純吉西他濱或紫杉醇組相比,GSI-IX提高了吉西他濱或紫杉醇對4種耐藥細胞的生長抑制作用。并且,不同濃度的GSI-IX對耐藥細胞的抑制作用不同,20um濃度,抑制作用最強。表明GSI-IX可提高了吉西他濱或紫杉醇的藥物敏感性。(5)檢測GSI-IX作用于4種耐藥細胞后,增加了細胞的凋亡,同時檢測Bcl-2和Bax的表達水平,結(jié)果顯示隨著GSI-IX作用濃度的增加,Bcl-2表達下調(diào)伴隨Bax表達水平上調(diào),據(jù)此,推測GSI-IX調(diào)控凋亡蛋白的表達,從而影響吉西他濱和紫杉醇對耐藥細胞的抗腫瘤作用。結(jié)論:(1)通過比較GSI-IX和紫杉醇、吉西他濱對肺癌細胞的作用,可以得出GSI-IX有如同化療藥物吉西他濱、紫杉醇類似的抗腫瘤作用。GSI-IX聯(lián)合吉西他濱可作為肺癌化療的新的治療方案。(2)GSI-IX能降低耐藥細胞中Notch3蛋白表達,且GSI-IX作用于耐藥細胞可提高不同耐藥細胞的生長抑制作用,同時能提高吉西他濱或紫杉醇的抗腫瘤作用。我們可以此推論Notch3信號通路參與腫瘤耐藥,阻斷Notch3信號通路可提高耐藥腫瘤細胞的藥物敏感性。(3)GSI-IX對耐藥細胞株可增加細胞的凋亡率,相關凋亡蛋白Bcl-2和Bax也呈現(xiàn)相應變化�？梢酝茰yGSI-IX通過調(diào)控凋亡途徑,從而改變耐藥H1299細胞和A549細胞對化療藥物的抵抗。表明GSI-IX有可能通過促進腫瘤細胞凋亡,從而達到治療非小細胞肺癌目的。
【圖文】：

安徽醫(yī)科大學博士學位論文同時單純 GSI-IX 組的細胞克隆減少率可堪比單純紫杉醇組。并且在這六組中，紫杉醇+ GSI-IX 組對細胞克隆數(shù)量減少的影響最大，其與單純紫杉醇組相比較，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，，（見圖 1）。這提示 GSI-IX 除了可通過抑制細胞克隆途徑抑制腫瘤生長，還可以提高紫杉醇對腫瘤細胞抑制作用的敏感性。

安徽醫(yī)科大學博士學位論文對照組、單純 GSI-IX 組、單純吉西他濱組和吉西他濱+DMSO 組和吉西他濱+GSI-IX 組。我們發(fā)現(xiàn)加入吉西他濱的三組對兩種細胞均不同程度的減少了細胞克隆數(shù)量，同時單純 GSI-IX 組的細胞克隆減少率可堪比單純吉西他濱組。并且在這六組中，吉西他濱+ GSI-IX 組對細胞克隆數(shù)量減少的影響最大，其與單純吉西他濱組相比較，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，（見圖 2）。這提示 GSI-IX 除了可通過抑制細胞克隆途徑抑制腫瘤生長，還可以提高吉西他濱對腫瘤細胞抑制作用的敏感性。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2

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