發(fā)布時(shí)間：2020-05-15 14:32

【摘要】：目的:近幾十年來,惡性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)的發(fā)病率和死亡率均明顯上升,其惡性程度較高,最多累及的器官是皮膚。雖然部分早期患者可通過手術(shù)治療得到治愈,而其較早轉(zhuǎn)移、死亡率高,放化療對其作用較差,很多患者預(yù)后不良。黑色素瘤的具體病因目前還不明確,主要認(rèn)為可能與過長時(shí)間紫外線照射有一定關(guān)系。所以,揭示惡性黑色素瘤發(fā)病分子機(jī)制,發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵分子或靶點(diǎn),對于診斷和治療惡性黑色素瘤具有重要的理論和臨床意義。Rsf-l是染色體重塑復(fù)合物ISWI的一個(gè)亞單位。染色體重塑復(fù)合物使染色質(zhì)發(fā)生重塑而調(diào)節(jié)核酸合成,轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),DNA修復(fù)、甲基化及重組等關(guān)鍵生物活動,該復(fù)合物的任何組成蛋白發(fā)生異常時(shí)會引起基因的異常表達(dá)和腫瘤的發(fā)生。近些年來,對于惡性黑色素瘤的研究很多,已表明11q13區(qū)的基因在食管癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、及惡性黑色素瘤中都有擴(kuò)增,同屬11q13.5染色體區(qū)的Rsf-1基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌等上皮惡性腫瘤中存在Rsf-1的過表達(dá)和/或基因擴(kuò)增,其表達(dá)上調(diào)與腫瘤的增殖、侵襲等等的不良生物學(xué)行為有關(guān),并且與腫瘤患者預(yù)后不良有關(guān),也有文獻(xiàn)報(bào)道稱擴(kuò)增后高表達(dá)的Rsf-1蛋白可以與hSNF2H形成RSF復(fù)合體,使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生重塑后使某些基因表達(dá)增強(qiáng)進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。但Rsf-1在惡性黑色素瘤中的表達(dá)情況及生物學(xué)作用尚未見報(bào)道。我們應(yīng)用免疫組化的方法檢測Rsf-1在惡性黑色素瘤中的表達(dá)情況,采用小RNA干擾技術(shù)敲除黑色素瘤細(xì)胞中的Rsf-1,檢測其對細(xì)胞的侵襲以及增殖、凋亡等生物學(xué)行為的影響,同時(shí)探討其可能發(fā)生分子機(jī)制。為進(jìn)一步惡性黑色素瘤的發(fā)病機(jī)理和生物學(xué)行為及尋找診斷和治療手段提供理論和臨床基礎(chǔ)。方法與結(jié)果:1、在人黑色素瘤組織標(biāo)本中檢測Rsf-1表達(dá)情況,對比癌與正常皮膚間的表達(dá)差異。我們選取52例黑色素瘤組織和對應(yīng)的正常皮膚組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rsf-1在腫瘤組織中表達(dá)明顯高于正常皮膚組織。與之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致,Rsf-1在惡性黑色素瘤中定位于細(xì)胞核,其陽性表達(dá)率為40.4%(21/52)。2、在人黑色素瘤細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染和干擾Rsf-1后,檢測Rsf-1對黑色素瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。我們在內(nèi)源性高表達(dá)Rsf-1的MV3和A375黑色素瘤細(xì)胞系中用siRNA敲除Rsf-1。在內(nèi)源性低表達(dá)Rsf-1的M14細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Rsf-1質(zhì)粒。MTT,克隆形成實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Rsf-1敲除抑制細(xì)胞增殖,阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程。而Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示下調(diào)Rsf-1抑制細(xì)胞侵襲。3、通過檢測細(xì)胞增殖及侵襲相關(guān)蛋白來探討Rsf-1促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞增殖和侵襲的可能機(jī)制。我們用Western Blot方法檢測黑色素瘤細(xì)胞中Rsf-1水平變化對細(xì)胞增殖及侵襲相關(guān)蛋白cyclin E,MMP2和p-IκB的影響。結(jié)果顯示,Rsf-1敲除能下調(diào)cyclin E,MMP2和p-IκB的蛋白水平。我們還通過免疫共沉淀的方法證實(shí)了Rsf-1和hSNF2H在黑色素瘤細(xì)胞中的結(jié)合。4、通過紫杉醇誘導(dǎo)凋亡后,轉(zhuǎn)染以及干擾Rsf-1,檢測Rsf-1對黑色素瘤細(xì)胞存活率,凋亡率以及線粒體膜電位變化的影響。我們在黑色素瘤細(xì)胞MV3,A375和M14中加入5μm的紫杉醇誘導(dǎo)凋亡,然后再干擾或轉(zhuǎn)染Rsf-1,調(diào)節(jié)Rsf-1的表達(dá)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抑制Rsf-1可以明顯減少惡性黑色素瘤細(xì)胞的存活率,Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡雙染實(shí)驗(yàn)顯示抑制Rsf-1可以明顯增加惡性黑色素瘤細(xì)胞的凋亡。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞線粒體膜電位變化顯示Rsf-1干擾可以下調(diào)腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位。5、通過檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白來探討Rsf-1抑制黑色素瘤細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。我們用Western Blot方法檢測黑色素瘤細(xì)胞中Rsf-1水平變化對凋亡抑制因子Bcl-2、cIAP1、cIAP2蛋白和促凋亡因子Bax的影響。結(jié)果顯示,Rsf-1敲除可以顯著減少凋亡抑制因子Bcl-2、cIAP1、cIAP2蛋白的表達(dá),增加促凋亡因子Bax蛋白的表達(dá)。細(xì)胞經(jīng)NF-κB信號通路抑制劑處理后,Western Blot方法檢測Rsf-1對Bcl-2以及bax的調(diào)控作用喪失。結(jié)論:1、Rsf-1在正常組織中表達(dá)明顯低于黑色素瘤,陽性表達(dá)率為40.4%(21/52)。2、干擾Rsf-1抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力。3、干擾Rsf-1下調(diào)黑色素瘤細(xì)胞中MMP2和cyclin E的表達(dá)及IκB的磷酸化。4、Rsf-1在黑色素瘤細(xì)胞中能與hSNF2H結(jié)合。5、干擾Rsf-1降低惡性黑色素瘤細(xì)胞經(jīng)紫杉醇誘導(dǎo)后的存活率,增加細(xì)胞的凋亡率,降低細(xì)胞線粒體膜電位。6、干擾Rsf-1減少凋亡抑制因子Bcl-2、cIAP1、cIAP2蛋白的表達(dá),增加促凋亡因子Bax蛋白的表達(dá)。7、干擾Rsf-1抑制黑色素瘤細(xì)胞中NF-κB信號通路活性水平。
【圖文】：

限將其分為四段，并且把他們分別記錄為強(qiáng)度相乘得到它的表達(dá)的分值，，我們規(guī)定中表明了正常的肺臟組織都≤4 分），并將≥3 結(jié)果比，Rsf-1 在人黑色素瘤組織標(biāo)本中組織化學(xué)方法檢測 52 例黑色素瘤組織，結(jié)果顯示 Rsf-1 在正常皮膚組織中呈現(xiàn)惡性黑色素瘤組織中呈現(xiàn)細(xì)胞核的陽性表 Rsf-1 呈中度陽性表達(dá)（圖 1-3），Rsf-1 性黑色素瘤細(xì)胞中 Rsf-1 呈陰性表達(dá)（圖

Rsf-1在惡性黑色素瘤中呈陰性表達(dá)（×200），細(xì)胞核染色呈陰性反應(yīng)（紫色）
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.5

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本文編號：2665186