【摘要】：結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是全球第三大常見的惡性腫瘤,全球每年新發(fā)病例數(shù)約為140萬例,其發(fā)病率在男性及女性中均處于惡性實(shí)體腫瘤的第3位,癌癥相關(guān)死亡原因已分別上升至第2位和第3位[1]。近年來,結(jié)直腸癌的發(fā)病率不斷上升,而我國的上升速度是國際平均增速(2%)的2倍,尤其在上海等東南沿海發(fā)達(dá)城市,發(fā)病率達(dá)到實(shí)體腫瘤的第二位,嚴(yán)重威脅著人類的健康和生活質(zhì)量[2,3]。腸癌發(fā)病隱匿,相當(dāng)一部分患者在首次就診確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]。目前對(duì)于晚期結(jié)直腸癌患者而言,姑息手術(shù)、新輔助放化療以及靶向藥物的應(yīng)用是主要治療手段,但又由于患者間個(gè)體差異和耐藥性的出現(xiàn)等,晚期結(jié)直腸癌的療效和預(yù)后不夠理想[5]。近年來,腫瘤的免疫治療越來越受到關(guān)注。2012年,被Science雜志評(píng)為未來值得關(guān)注的六大領(lǐng)域之一[6];2013年,又被Science雜志評(píng)為“年度十大進(jìn)展之首”[7];并連續(xù)成為2015、2016年全球腫瘤研究頂級(jí)盛會(huì)——美國臨床腫瘤學(xué)會(huì)(ASCO)熱點(diǎn)中的焦點(diǎn),當(dāng)仁不讓的成為了會(huì)議的主旋律[8,9]。Topalian博士因其在PD-1和PD-L1免疫治療研究的突出貢獻(xiàn),被授予2015年“David A.Karnofsky Memorial Award”(ASCO最重要的獎(jiǎng)項(xiàng))。目前,大量的基礎(chǔ)和臨床研究已經(jīng)聚焦腫瘤免疫治療。結(jié)直腸癌患者也從免疫治療中看到了希望,尤其是錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷(Mismatch repair deficiency,dMMR)的CRC患者,對(duì)PD-1單抗藥物的敏感性比微衛(wèi)星穩(wěn)定性(Microsatellite stability,MSS)患者顯著提高[10]。微衛(wèi)星不穩(wěn)定(Microsatellite instability,MSI)是結(jié)直腸癌發(fā)病的重要原因之一。它是指MSH2、MSH6、MLH1、PMS1和PMS2等錯(cuò)配修復(fù)基因發(fā)生突變導(dǎo)致DNA重復(fù)序列(微衛(wèi)星)的增加或缺失,進(jìn)而引起腫瘤的發(fā)生[11,12]。由于微衛(wèi)星序列突變累積,蛋白質(zhì)翻譯過程中發(fā)生框移突變,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生了大量異常的多肽片段,這些片段更容易被免疫系統(tǒng)所識(shí)別,激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)[13],這也是微衛(wèi)星不穩(wěn)定患者對(duì)PD-1單抗敏感的主要原因。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性在散發(fā)性結(jié)直腸癌中的發(fā)生頻率大約僅為15%[14]。但是對(duì)于大部分微衛(wèi)星穩(wěn)定性的結(jié)直腸癌患者而言,PD-1單抗難以取得顯著的療效,如何提高這部分患者的療效成為結(jié)直腸癌治療的重大問題。目前,腫瘤免疫療法聯(lián)合治療的應(yīng)用已經(jīng)成為全球科學(xué)家的共識(shí),綜合治療依舊是癌癥的理想治療模式。在與腫瘤抗?fàn)幍膸装倌陙?人們已經(jīng)意識(shí)到單憑一種療法是無法攻克腫瘤這一頑疾的。只有通過不同機(jī)制的抗腫瘤協(xié)同治療,如傳統(tǒng)放化療與免疫療法聯(lián)用、治療性疫苗與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)用、CAR-T療法與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)用、靶向藥物與免疫療法聯(lián)用,以及腫瘤免疫療法與基因療法聯(lián)用等[15-19]。在傳統(tǒng)的手術(shù)、放療以及化療使腫瘤細(xì)胞負(fù)荷明顯降低,機(jī)體的免疫功能得以改善的基礎(chǔ)上,通過聯(lián)合適當(dāng)?shù)哪[瘤免疫治療,可以清除微小的殘留病灶或抑制殘留癌癥細(xì)胞增殖,改善癌癥患者的預(yù)后,延長生存時(shí)間,提高生活質(zhì)量,從而達(dá)到治愈癌癥的目的。深入理解腫瘤和免疫系統(tǒng)之間的相互作用,利用各種免疫治療手段的優(yōu)勢(shì),互相協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用,優(yōu)化腫瘤治療方案成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。地西他濱(5-aza-2'-deoxynucleoside,DAC)是一種腺苷類似物,通過抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶,降低DNA的甲基化水平,從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,是作用能力較強(qiáng)的DNA甲基化特異性抑制劑,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于骨髓增生異常綜合征、急性白血病的治療,作為甲基化抑制劑也在實(shí)體瘤中被廣泛研究。研究證明,低劑量DAC不僅可以明顯誘導(dǎo)和提高腫瘤抗原的表達(dá),如NY-ESO-1、MAGE-A3/6等,還能提高CD80、MHC-I類分子等免疫標(biāo)志物的表達(dá)[20,21],進(jìn)而增加腫瘤局部免疫細(xì)胞的浸潤,為免疫檢查點(diǎn)抑制劑、治療性疫苗、過繼性細(xì)胞治療等免疫療法提供了更加適合的免疫微環(huán)境。本課題旨在研究低劑量DAC對(duì)腫瘤生物學(xué)特征、免疫原性的影響以及對(duì)腫瘤微環(huán)境的作用及其機(jī)制,探討其與PD-1單抗、NY-ESO-1特異性TCR-T細(xì)胞等免疫治療的協(xié)同效應(yīng),為MSS結(jié)直腸癌的臨床治療提供新的策略和科學(xué)依據(jù)。本研究主要分為三個(gè)部分:第一部分:低劑量地西他濱對(duì)腫瘤的表觀修飾作用研究DNA甲基化是一種不改變基因堿基序列的可逆的基因修飾,其甲基化水平與基因的“開放”狀態(tài)密切相關(guān)。基于低劑量DAC的去甲基化作用,我們對(duì)微衛(wèi)星穩(wěn)定的小鼠腸癌細(xì)胞系CT26[22]進(jìn)行了DAC處理,提取了基因組DNA和總RNA,利用全基因組甲基化測(cè)序(WGBS)和全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)對(duì)腫瘤細(xì)胞的特征改變進(jìn)行了檢測(cè)和分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CT26細(xì)胞經(jīng)過DAC處理后,基因組總體甲基化水平顯著下調(diào)。其中,抗原加工和遞呈相關(guān)基因、細(xì)胞因子相關(guān)基因和趨化因子以及STAT基因、免疫應(yīng)答相關(guān)基因、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑基因和PI3K-AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)基因中啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平顯著下調(diào)。全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示,CT26細(xì)胞的表達(dá)譜明顯改變,發(fā)現(xiàn)大量差異表達(dá)的功能相關(guān)基因,包括180個(gè)上調(diào)的基因和139個(gè)下調(diào)的基因。我們著重關(guān)注了WGBS結(jié)果中甲基化水平發(fā)生變化的mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),抗原加工和遞呈相關(guān)基因、細(xì)胞因子相關(guān)基因、趨化因子相關(guān)基因,STAT基因,免疫應(yīng)答相關(guān)基因,MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑基因和PI3K-AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑基因的表達(dá)發(fā)生明顯改變。值得注意的是,抗原加工和遞呈相關(guān)基因顯著上調(diào)。這表明基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化水平可以抑制基因的表達(dá),當(dāng)甲基化水平被下調(diào)時(shí),基因表達(dá)重新被激活,表達(dá)水平上升,即上述基因的表達(dá)水平與其啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平具有相關(guān)性。腫瘤細(xì)胞在經(jīng)過DAC處理后,基因組甲基化水平明顯下降,細(xì)胞表達(dá)譜發(fā)生了明顯變化,其免疫原性得到提高。同時(shí),我們收集了臨床患者的新鮮腫瘤組織,在重度免疫缺陷NCG小鼠上構(gòu)建了CRC的PDX模型,并根據(jù)美國國立癌癥研究所Boland等[23]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了微衛(wèi)星狀態(tài)的鑒定。我們選取了MSS的PDX模型予以DAC處理,提取了腫瘤組織的基因組DNA和總RNA,也進(jìn)行了WGBS和RNA-seq檢測(cè)和分析。我們發(fā)現(xiàn)了與CT26細(xì)胞經(jīng)DAC處理后類似的現(xiàn)象:PDX模型的腫瘤細(xì)胞經(jīng)過DAC處理后,其甲基化水平顯著下調(diào)。其中,抗原加工和遞呈相關(guān)基因,免疫相關(guān)基因和蛋白質(zhì)修飾基因中啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平被下調(diào)。表達(dá)譜也發(fā)生了顯著變化,其中有89個(gè)基因顯著上調(diào),50個(gè)基因顯著下調(diào)。上調(diào)基因主要是抗原加工和遞呈基因,免疫相關(guān)基因和蛋白修飾基因,與WGBS結(jié)果顯示的低甲基化水平具有一致性。這說明低劑量DAC改變了PDX腫瘤的特性,提高了其免疫原性。為了探究DAC對(duì)不同微衛(wèi)星狀態(tài)的CRC細(xì)胞的影響,我們選取了兩株MSI細(xì)胞HCT116、LOVO和兩株MSS細(xì)胞HT29、SW480,用0μM、0.1μM、1μM、10μM等不同濃度的DAC進(jìn)行處理,在處理后的不同時(shí)間點(diǎn)(第1天,第3天,第7天)收集了腫瘤細(xì)胞的總RNA、DNA和蛋白質(zhì),通過qPCR、Western Blot等技術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞中NY-ESO-1抗原mRNA和蛋白的表達(dá)水平,并通過甲基化測(cè)序檢測(cè)了基因組DNA中NY-ESO-1啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況。結(jié)果顯示,低劑量DAC可誘導(dǎo)或提高CRC細(xì)胞系中NY-ESO-1基因的表達(dá)。在MSS細(xì)胞系中,HT29和SW480的NY-ESO-1表達(dá)需要更低濃度DAC的誘導(dǎo),誘導(dǎo)所需的時(shí)間也更短,NY-ESO-1表達(dá)水平比未處理的細(xì)胞平均升高20-30倍,顯著的高于MSI細(xì)胞中的5-10倍。而NY-ESO-1啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平與其基因表達(dá)水平也密切相關(guān),甲基化水平越低,其表達(dá)水平越高。通過第一部分的研究,我們證實(shí)了小鼠微衛(wèi)星穩(wěn)定性腸癌細(xì)胞系CT26細(xì)胞經(jīng)過低劑量DAC處理后,其基因組甲基化水平明顯下調(diào),重新激活或上調(diào)了大量功能基因的表達(dá),改變了腫瘤的免疫學(xué)特征,提高了其免疫原性。在PDX腫瘤模型中,這一現(xiàn)象得到了再次驗(yàn)證。該部分研究結(jié)果為下一步的研究提供了理論依據(jù)。第二部分:低劑量地西他濱對(duì)腫瘤微環(huán)境的作用研究影響免疫治療在實(shí)體瘤中療效的主要問題是腫瘤抑制性的免疫微環(huán)境。如何打破和重塑腫瘤微環(huán)境,激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答是實(shí)體瘤治療取得突破的關(guān)鍵。腫瘤微環(huán)境中的免疫微環(huán)境決定了免疫治療的有效性[24-27],而免疫相關(guān)分子的表達(dá)及細(xì)胞的浸潤是腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵組成。第一部分中,我們已經(jīng)證實(shí)了低劑量DAC可以改變腫瘤的特征,提高其免疫原性。我們又構(gòu)建了CT26荷瘤小鼠模型,給予荷瘤小鼠DAC處理,同時(shí)PBS和Cytidine(胞嘧啶類似物)作為對(duì)照,收集了DAC處理后不同時(shí)間點(diǎn)(處理前,處理后1天,處理后3天,處理后7天,處理后14天)的腫瘤組織,通過免疫組化檢測(cè)腫瘤微環(huán)境中的淋巴細(xì)胞浸潤情況和細(xì)胞狀態(tài)等,進(jìn)一步探究了低劑量DAC對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響。我們發(fā)現(xiàn),在低劑量DAC處理后,隨著時(shí)間的延長,浸潤到腫瘤局部的T淋巴細(xì)胞越來越多,7-14天后達(dá)到峰值。進(jìn)一步檢測(cè)腫瘤微環(huán)境中的CD3~+T細(xì)胞、CD4~+T細(xì)胞、CD8~+T細(xì)胞的浸潤,分泌IFN-γ細(xì)胞因子的細(xì)胞數(shù)量以及PD-1的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)DAC處理組相比于對(duì)照組有更多的T淋巴細(xì)胞浸潤,包括CD4~+T淋巴細(xì)胞和CD8~+T淋巴細(xì)胞;且分泌IFN-γ細(xì)胞因子的細(xì)胞數(shù)量顯著高于PBS組和Cytidine組。值得注意的是,我們發(fā)現(xiàn)大部分浸潤的T淋巴細(xì)胞均為PD-1陽性,這表明DAC對(duì)于TME的影響作用可能通過PD-1/PD-L1通路被抑制。通過第二部分的研究,我們發(fā)現(xiàn)了低劑量DAC可以重塑腫瘤微環(huán)境,召募更多的T淋巴細(xì)胞,包括CD4~+T細(xì)胞、CD8~+T細(xì)胞,浸潤到腫瘤局部,且大部分細(xì)胞分泌高水平的IFN-γ,但是這些細(xì)胞大部分是PD-1陽性的,其功能可能通過PD-1/PD-L1通路被抑制。第三部分:地西他濱為基礎(chǔ)的協(xié)同免疫治療策略的研究一、地西他濱與PD-1抑制劑協(xié)同性治療策略研究研究證明,PD-1單抗對(duì)于MSS腫瘤基本上是無效的[10]。通過前面兩部分的研究,我們發(fā)現(xiàn)低劑量DAC可以改變腫瘤的免疫學(xué)特征,提高其免疫原性,且能夠召募大量的T淋巴細(xì)胞浸潤到腫瘤局部,從而有可能對(duì)腫瘤微環(huán)境進(jìn)行重塑。但是這部分浸潤到腫瘤局部的T淋巴細(xì)胞大部分為PD-1陽性,因此我們緊接著聯(lián)合應(yīng)用PD-1單抗,探討協(xié)同效應(yīng)提高療效的可能性。在這一部分中,我們首先選取CT-26小鼠腸癌細(xì)胞構(gòu)建了MSS的荷瘤小鼠模型,給予了DAC+PD-1單抗聯(lián)合用藥的治療方法,將PBS、PD-1單抗單藥、DAC單藥治療作為對(duì)照組,探討了DAC與PD-1單抗協(xié)同治療的療效。結(jié)果顯示,DAC+PD-1單抗組與PD-1單抗組、DAC單藥組相比,對(duì)腫瘤生長具有明顯的抑制作用,延長小鼠生存期的效應(yīng)也更加顯著。結(jié)果表明,DAC的預(yù)處理聯(lián)合PD-1單抗的治療方法,能夠明顯抑制MSS荷瘤小鼠的腫瘤生長和延長其生存期,結(jié)合第一部分的體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn),其機(jī)制可能是由于DAC對(duì)腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)而招募到腫瘤局部的PD-1陽性的T淋巴細(xì)胞被PD-1單抗解除抑制,從而在腫瘤局部發(fā)揮了抗腫瘤效應(yīng)。二、地西他濱與TCR-T細(xì)胞治療協(xié)同性治療策略研究在第一部分中,我們證實(shí)了DAC可以誘導(dǎo)和提高M(jìn)SS腫瘤細(xì)胞NY-ESO-1抗原的表達(dá),而腫瘤抗原的表達(dá)直接決定著特異性細(xì)胞免疫治療的效應(yīng)。因此,我們探索了將DAC與NY-ESO-1特異性的T細(xì)胞進(jìn)行協(xié)同治療的療效。首先,我們從文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫中獲得了NY-ESO-1_(157-165)(SLLMWITQC)特異性TCRα/β基因序列,將α鏈95-96位的TS突變?yōu)長Y,以提高其抗原特異性殺傷功能[28,29];另外,將α鏈的Thr~(48)和β鏈的Ser~(57)突變成Cys,有利于形成二硫鍵,提高其與外源基因的匹配成功率[30]。TCRα/β鏈基因之間用具有“self-cleavege”功能的P2A連接,使翻譯出來的產(chǎn)物能夠被剪切成α/β鏈,從而更好地進(jìn)行匹配[30,31]。優(yōu)化后的序列克隆入慢病毒過表達(dá)載體,利用HEK-293T細(xì)胞包裝慢病毒。隨后,我們又從人的外周血中分離出淋巴細(xì)胞,經(jīng)過流式檢測(cè)HLA-A2表型,篩選出HLA-A2強(qiáng)陽性的淋巴細(xì)胞經(jīng)CD3~+/CD28~+Dynabeads進(jìn)行分選和活化。利用包裝好的慢病毒轉(zhuǎn)染活化的CD3~+/CD28~+/HLA-A2~+淋巴細(xì)胞,流式檢測(cè)其TCR表達(dá)情況,MHC-Tetramer檢測(cè)其與抗原的結(jié)合能力。結(jié)果顯示,特異性TCR的轉(zhuǎn)染效率為56%,四聚體檢測(cè)其特異性結(jié)合的陽性率為15%,說明我們成功制備了NY-ESO-1特異性TCR-T細(xì)胞。為了在體外檢測(cè)所構(gòu)建的TCR-T細(xì)胞能否識(shí)別NY-ESO-1抗原并分泌細(xì)胞因子,我們將HLA-A2特異性的NY-ESO-1_(157-165)(SLLMWITQC)多肽和無關(guān)同源多肽OVA_(257-264)(SIINFEKL)負(fù)載到T2細(xì)胞上作為靶細(xì)胞,所構(gòu)建的TCR-T細(xì)胞與負(fù)載抗原的T2細(xì)胞共培養(yǎng)24 h,ELISPOT檢測(cè)培養(yǎng)上清中IFN-γ的釋放,結(jié)果顯示,與負(fù)載NY-ESO-1_(157-165)的T2細(xì)胞共培養(yǎng)的TCR-T細(xì)胞能夠高分泌IFN-γ,并且明顯高于負(fù)載無關(guān)同源多肽的T2細(xì)胞所共培養(yǎng)的TCR-T細(xì)胞。以上結(jié)果表明所構(gòu)建的TCR-T細(xì)胞可以特異性的識(shí)別T2細(xì)胞上的NY-ESO-1并誘導(dǎo)分泌細(xì)胞因子IFN-γ。隨后,我們通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了所構(gòu)建TCR-T細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。選取了HLA-A2和NY-ESO-1不同表型的腫瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞:LOVO(NY-ESO-1~-/HLA-A2~-),MGC 803(NY-ESO-1~+/HLA-A2~-),SW480(NY-ESO-1~±/HLA-A2~+),A375細(xì)胞(NY-ESO-1~(++)/HLA-A2~+)做陽性對(duì)照,以及根據(jù)第一部分WB結(jié)果,經(jīng)過1μM DAC誘導(dǎo)的HCT116(NY-ESO-1~+/HLA-A2~+)。將靶細(xì)胞與所構(gòu)建的TCR-T細(xì)胞共培養(yǎng),LDH Assay檢測(cè)TCR-T的殺傷效應(yīng),ELISPOT檢測(cè)TCR-T的IFN-γ的分泌。結(jié)果顯示,A375、HCT116與TCR-T細(xì)胞共培養(yǎng)的孔中可見大量斑點(diǎn)形成,數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于LOVO、MGC 803、SW480與TCR-T共培養(yǎng)的孔,即與A375、HCT116共培養(yǎng)的TCR-T細(xì)胞釋放了大量的IFN-γ。相應(yīng)地,A375、HCT116與TCR-T細(xì)胞共培養(yǎng)的孔中檢測(cè)到大量LDH的釋放,其含量遠(yuǎn)高于LOVO、MGC 803、SW480與TCR-T共培養(yǎng)的孔,即TCR-T細(xì)胞對(duì)A375、HCT116細(xì)胞產(chǎn)生了較好的殺傷效應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)說明,TCR-T細(xì)胞對(duì)NY-ESO-1~+/HLA-A2~+細(xì)胞具有特異性的殺傷作用,對(duì)于NY-ESO-1或HLA-A2單陽性或雙陰性的細(xì)胞沒有殺傷效應(yīng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,我們構(gòu)建了A375荷瘤小鼠模型,予以所獲得的TCR-T細(xì)胞輸注治療,PBS和空病毒轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞(ctrl-T細(xì)胞)作為對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn),所構(gòu)建的TCR-T細(xì)胞能夠顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長,并顯著延長小鼠的生存時(shí)間。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),我們所構(gòu)建的NY-ESO-1特異性TCR-T細(xì)胞在體內(nèi)和體外均可有抗原特異性的IFN-γ的分泌,并且具有HLA-A2限制性的NY-ESO-1特異性的腫瘤殺傷效應(yīng)。在成功獲得NY-ESO-1 TCR-T細(xì)胞后,我們進(jìn)一步研究了DAC與TCR-T細(xì)胞是否具有協(xié)同治療效應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)中,我們采用0μM、0.1μM、1μM等不同濃度的DAC處理SW480細(xì)胞(NY-ESO-1~±/HLA-A2~+),并按照10:1、20:1、40:1等不同的效靶比與所構(gòu)建的TCR-T細(xì)胞共培養(yǎng)。結(jié)果證明,與未誘導(dǎo)的SW480細(xì)胞組相比,DAC誘導(dǎo)過的SW480細(xì)胞與所構(gòu)建的TCR-T細(xì)胞共培養(yǎng)后,LDH Assay檢測(cè)顯示所構(gòu)建的TCR-T細(xì)胞對(duì)DAC處理的SW480細(xì)胞的殺傷效應(yīng)明顯高于未處理的SW480細(xì)胞。ELISPOT結(jié)果顯示,與未處理的SW480細(xì)胞組相比,DAC誘導(dǎo)過的SW480細(xì)胞與所構(gòu)建的TCR-T細(xì)胞共培養(yǎng)后,上清中IFN-γ細(xì)胞因子的水平明顯升高。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,我們將0μM、0.1μM、1μM等不同濃度的DAC處理的SW480細(xì)胞接種到重癥免疫缺陷NPG小鼠皮下,構(gòu)建了MSS的SW480荷瘤小鼠模型,然后進(jìn)行所構(gòu)建的TCR-T細(xì)胞的輸注治療,每周一次,共三次,同時(shí)PBS和空病毒轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞(ctrl-T細(xì)胞)作為對(duì)照,結(jié)果顯示,未經(jīng)DAC誘導(dǎo)的SW480細(xì)胞和經(jīng)過0.1μM DAC處理的SW480細(xì)胞組,在經(jīng)過TCR-T細(xì)胞治療后,其腫瘤生長得到一定的抑制,但是生存時(shí)間并沒有得到延長。1μM DAC處理組經(jīng)過TCR-T細(xì)胞的輸注治療后,腫瘤生長的抑制效應(yīng)和生存期的延長明顯高于其它組。上述結(jié)果表明,MSS腫瘤細(xì)胞經(jīng)過適當(dāng)濃度的DAC(1μM)的處理,能夠明顯的提高其對(duì)于TCR-T細(xì)胞的殺傷敏感性,從而抑制MSS腫瘤的生長并提高生存期,證實(shí)適量DAC與TCR-T細(xì)胞聯(lián)合治療具有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。通過本部分的研究,我們通過將DAC分別與兩種免疫治療方法PD-1單抗、NY-ESO-1特異性TCR-T細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用,通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),證實(shí)了DAC可以提高PD-1單抗、NY-ESO-1特異性TCR-T細(xì)胞的免疫治療的療效,對(duì)MSS腫瘤發(fā)揮了協(xié)同治療效應(yīng),為MSS腫瘤患者提供了新的治療策略和依據(jù)。同時(shí),DAC特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)NY-ESO-1等多種腫瘤抗原,為治療性疫苗、TCR-T細(xì)胞等以抗原為基礎(chǔ)的免疫治療提供了更多的靶點(diǎn),以DAC為基礎(chǔ)的協(xié)同免疫治療有望顯著提高實(shí)體腫瘤患者的臨床療效。全文結(jié)果與結(jié)論:1、低劑量DAC可以顯著降低小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞CT26細(xì)胞以及人MSS性CRC的PDX模型腫瘤細(xì)胞基因組甲基化水平,提高結(jié)直腸癌細(xì)胞中抗原加工遞呈、細(xì)胞因子等基因的表達(dá)水平。低劑量DAC能夠通過靶基因啟動(dòng)子區(qū)的去甲基化作用,誘導(dǎo)和提高M(jìn)SI-H以及MSS性CRC細(xì)胞中NY-ESO-1抗原的表達(dá)。說明低劑量DAC改變了CRC細(xì)胞的免疫學(xué)特性,提高了其免疫原性。2、經(jīng)過低劑量DAC處理后的CRC腫瘤可以招募更多的CD4~+和CD8~+T淋巴細(xì)胞浸潤到腫瘤局部,具有更多的高分泌IFN-γ的細(xì)胞。這些浸潤的T淋巴細(xì)胞大多呈現(xiàn)PD-1陽性。說明低劑量DAC改變了CRC的腫瘤微環(huán)境,但是其狀態(tài)可能通過PD/PD-L1通路被抑制。3、低劑量DAC與PD-1單抗聯(lián)合應(yīng)用可以顯著抑制小鼠體內(nèi)CRC腫瘤CT26的生長,并延長小鼠的生存期。說明低劑量DAC為PD-1單抗療效的發(fā)揮提供了良好的腫瘤微環(huán)境,而PD-1單抗再次激活了腫瘤微環(huán)境中被PD-1/PD-L1通路抑制的T淋巴細(xì)胞,發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。DAC和PD-1單抗能夠發(fā)揮協(xié)同性作用,提高抗腫瘤療效。4、通過慢病毒轉(zhuǎn)染人外周血T淋巴細(xì)胞,成功制備了NY-ESO-1特異性TCR-T細(xì)胞,并在體內(nèi)外進(jìn)行了功能驗(yàn)證。所制備的TCR-T細(xì)胞對(duì)HLA-A2限制性的NY-ESO-1陽性腫瘤具有良好的特異性識(shí)別和殺傷能力。5、低劑量DAC的預(yù)處理可以提高M(jìn)SS性結(jié)直腸癌細(xì)胞中NY-ESO-1抗原的表達(dá)水平,與TCR-T細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用可以明顯抑制腫瘤生長,延長小鼠生存期。說明低劑量DAC對(duì)腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)為TCR-T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)提供更多的靶點(diǎn),提高TCR-T細(xì)胞治療的療效,兩者具有協(xié)同作用。
【圖文】：

- 32 -圖 1：CT26 細(xì)胞的全基因組甲基化測(cè)序結(jié)果Figure 1: Low dose DAC decreased the methylation level of promoter region in CT26 cells.(A) Violin map showed the methylation level of the control and the DAC-treated CT26 cells.Each violin represented a sample and every10 kb was regarded as a bin. (B) Comparison ofthe methylation level of antigen processing and presenting gene promoter regions in thecontrol and the DAC-treated CT26 cells. (C) Comparison of the methylation level ofrepresentative differentially expressed genes of the control and the DAC-treated CT26 cells.

也發(fā)現(xiàn)了與 CT26 細(xì)胞類似的結(jié)果。PDX 模型的腫瘤細(xì)胞經(jīng)過 DAC 處理后，其甲基化水平顯著下調(diào)（圖2A）。聚類分析發(fā)現(xiàn)，抗原加工和遞呈基因，，免疫相關(guān)基因和蛋白質(zhì)修飾基因中啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平明顯下調(diào)（圖 2B）。低劑量 DAC 能夠顯著降低 PDX 模型中腫瘤細(xì)胞的甲基化水平說明其在體內(nèi)也同樣可以發(fā)揮去甲基化的作用。圖 2：PDX 腫瘤的全基因組甲基化測(cè)序結(jié)果Figure 2: Low dose DAC decreased the methylation level of promoter region in tumors fromthe PDX model. (A) Violin map showed the methylation level of the control and the DAC-treated tumors. (B) Comparison of the methylation level of representative differentiallyexpressed genes in the control and the DAC-treated tumors.3. 低劑量 DAC 對(duì) CT26 細(xì)胞表達(dá)譜的影響為了闡明低劑量 DAC 作用后的腫瘤細(xì)胞其基因的甲基化水平與表達(dá)之間的關(guān)系，我們對(duì)低劑量 DAC 處理和未處理的 CT26 細(xì)胞進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。PCA 分析結(jié)果顯示，分別代表 CT26 細(xì)胞經(jīng) DAC 處理前、后的兩個(gè)點(diǎn)相距很遠(yuǎn)（圖 3A，紅色點(diǎn)代表 DAC 處理前，藍(lán)色點(diǎn)代表 DAC 處理后），說明 CT26 細(xì)胞在經(jīng)過低劑量 DAC 處
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.34

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本文編號(hào)：2665039