【摘要】：目的:通過研究急性髓系白血病(acute myeloblastic leukemia,AML)、骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes,MDS)和慢性髓細胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)等髓系腫瘤骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSC)的生物學和遺傳學特性的改變,探討髓系腫瘤骨髓微環(huán)境(bone marrow microenvironment,BMM)的變化。方法:(1)MSC的分離和鑒定:首先采用Ficoll淋巴細胞分離液分離骨髓單個核細胞(mononuclear cells,MNC),然后采用貼壁法去除懸浮細胞,留下貼壁細胞。采用流式細胞術、誘導分化實驗和集落形成實驗對分離的MSC進行鑒定;(2)MSC生物學特性分析:CCK8法、集落形成實驗檢測MSC的增殖能力,衰老β半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色法檢測MSC的衰老細胞比例,長期共培養(yǎng)起始細胞(long-term culture-initiating cell,LTC-IC)實驗檢測MSC的造血支持能力;(3)MSC遺傳學分析:應用常規(guī)核型分析(conventional cytogenetic analysis,CCA)和熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技術檢測骨髓造血細胞(hematopoietic cells,HC)和MSC的細胞遺傳學,MDS患者骨髓FISH檢測采用MDS組套探針,CML患者采用bcr-abl雙色雙融合探針;NGS技術檢測AML患者與MDS患者骨髓HC和MSC的熱點基因突變。結果:1.MSC的分離與鑒定:取第3代分離的貼壁細胞進行鑒定。(1)經(jīng)流式細胞術檢測,該貼壁細胞不表達HC的標志抗原,如CD45和CD34;表達CD44、CD73、CD90和CD105。(2)誘導分化實驗表明貼壁細胞可向成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞分化,說明該貼壁細胞具有多向分化的潛能。(3)集落形成實驗表明,單個貼壁細胞能夠增殖形成經(jīng)染色后肉眼可見的克隆單位,說明該貼壁細胞具有自我更新的干細胞特性。上述鑒定結果均符合國際治療學會(international Society for Cellular Therapy,ISCT)制定的鑒定MSC的最低標準,因此可以認為所分離純化的貼壁細胞為MSC。2.MSC的生物學特性:髓系腫瘤組(AML、MDS或CML患者)與健康供者(healthy donor,HD)對照組骨髓MSC在增殖能力、衰老細胞比例以及造血支持能力等三方面存在的差異。CCK8法檢測結果顯示:從第3-4d開始,髓系腫瘤組的增殖速度顯著低于對照組;但髓系腫瘤組內(nèi)無明顯差異。同樣,集落形成實驗也表明,較HD組,髓系腫瘤組的增殖能力顯著降低,但各腫瘤組內(nèi)無明顯差異。HD、AML、MDS和CML的集落形成個數(shù)分別為:13.55±2.73、9.73±2.53、7.75±1.91與7.60±3.06。SA-β-Gal染色實驗結果為:第8代AML、MDS和CML骨髓MSC的衰老細胞占比分別為56.38±6.23%、53.75±14.66%和60.17±6.52%,顯著高于HD組的衰老細胞占比(23.14±4.18%)�？梢�,髓系腫瘤骨髓MSC較HD-MSC更容易衰老。將骨髓MSC與HD骨髓CD34~+HSC長期共培養(yǎng),通過計數(shù)起始細胞數(shù)來評估MSC的造血支持能力。相比于對照組,與髓系腫瘤組MSC長期共培養(yǎng)后的HD骨髓CD34~+HSC所形成的集落個數(shù)明顯減少。髓系腫瘤組的起始細胞數(shù)(CFU-GM、CFU-E和BFU-E集落個數(shù)總和)約為HD組的1/3,說明髓系腫瘤組MSC造血支持能力受損,但組內(nèi)無明顯差異。3.MSC的遺傳學特征:分析AML、MDS和CML患者骨髓MSC和HC的細胞遺傳學及熱點基因的突變情況以探究髓系腫瘤MSC與HC遺傳學特性及其關系。行CCA檢測29例AML患者骨髓HC和MSC的細胞核型,其中骨髓HC檢出異常核型的患者有16例,但在骨髓MSC中均未檢出細胞遺傳學異常。聯(lián)合CCA和FISH檢測37例MDS患者和15例CML患者骨髓MSC與HC的特異性位點的染色體異常。34例MDS患者骨髓HC培養(yǎng)成功、有分裂相,其中16例檢出核型異常;但骨髓MSC的細胞核型均未檢出異常;10例MDS患者骨髓HC經(jīng)FISH檢出5q-、7q-和+8等位點的改變,但其骨髓MSC的檢測結果也均為陰性。CML患者骨髓HC均檢出費城染色體和bcr-abl融合基因,但骨髓MSC均未檢出。采用二代測序(next-generation sequencing,NGS)技術進一步檢測AML和MDS骨髓HC和MSC熱點基因,發(fā)現(xiàn)送檢標本的HC均檢出若干個基因突變,但是,僅有1例AML患者的MSC樣本檢出AXSL1基因突變。結論:密度梯度離心法聯(lián)合貼壁法分離MSC方法可靠,所提取的MSC具有干細胞特性,符合ISCT制定的定義MSC的最小鑒定標準。髓系腫瘤患者骨髓MSC生物學功能受損,表現(xiàn)為MSC增殖能力、自我更新能力和造血支持功能均減弱,具有明顯衰老傾向。遺傳學特征在髓系腫瘤患者骨髓MSC與骨髓HC之間無相關性。
【圖文】：

結 果細胞鑒定該部分研究所采用的細胞來自 HD 骨髓。原代細胞培養(yǎng)時，懸浮與貼壁，經(jīng)過第 1 代和第 2 代的純化培養(yǎng)，直至第 3 代，懸浮細胞已完全去除壁生長的梭形細胞可用于細胞鑒定。 細胞表面標志物鑒定采用流式細胞術檢測細胞表面標志物，結果顯示：貼壁細胞均不表達 HC原，如 CD34 和 CD45；表達 CD44、CD73、CD90 和 CD105，陽性率均，符合 ISCT 制定的鑒定 MSC 的最低標準[19]。圖 1 展示的是 HD（N2，者 2 號）骨髓貼壁細胞的檢測結果：CD34 和 CD45 的陽性表達為 0.9%和 044、CD73、CD90 和 CD105 的陽性率分別為 99.8%、99.7%、99.2%和 99

2 多向分化能力鑒定對貼壁細胞行成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞誘導分化培養(yǎng)。其形態(tài)從纖胞樣的貼壁細胞分別逐漸分化成三種細胞形態(tài)：①成骨細胞誘導分化培養(yǎng)實，，細胞分化成富含鈣結節(jié)的成骨細胞（圖 2a），其鈣質沉淀經(jīng)茜素紅媒染后紅色（圖 2g）；②成脂肪細胞誘導分化培養(yǎng)實驗中，細胞分化成聚集脂質空脂肪細胞（圖 2b），中性脂肪滴經(jīng)油紅 O 染為橘紅色，胞質經(jīng)蘇木素復染為（圖 2h）；③成軟骨細胞誘導分化培養(yǎng)實驗中，細胞分化成多角形的軟骨細圖 2c），其軟骨形成基質經(jīng)阿利新藍染料染為藍色，而胞核不著色（圖 2i）照組的細胞染色后未見陽性細胞（圖 2 d-f）。該部分實驗結果表明本項目所的方法分離出的貼壁細胞具有多向分化的干細胞特性。成骨分化 成脂分化 成軟骨分化分化已
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R733;R730.43

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