【摘要】：目的:通過研究急性髓系白血病(acute myeloblastic leukemia,AML)、骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes,MDS)和慢性髓細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)等髓系腫瘤骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)的生物學(xué)和遺傳學(xué)特性的改變,探討髓系腫瘤骨髓微環(huán)境(bone marrow microenvironment,BMM)的變化。方法:(1)MSC的分離和鑒定:首先采用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells,MNC),然后采用貼壁法去除懸浮細(xì)胞,留下貼壁細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)、誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)和集落形成實(shí)驗(yàn)對(duì)分離的MSC進(jìn)行鑒定;(2)MSC生物學(xué)特性分析:CCK8法、集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MSC的增殖能力,衰老β半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色法檢測(cè)MSC的衰老細(xì)胞比例,長(zhǎng)期共培養(yǎng)起始細(xì)胞(long-term culture-initiating cell,LTC-IC)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MSC的造血支持能力;(3)MSC遺傳學(xué)分析:應(yīng)用常規(guī)核型分析(conventional cytogenetic analysis,CCA)和熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技術(shù)檢測(cè)骨髓造血細(xì)胞(hematopoietic cells,HC)和MSC的細(xì)胞遺傳學(xué),MDS患者骨髓FISH檢測(cè)采用MDS組套探針,CML患者采用bcr-abl雙色雙融合探針;NGS技術(shù)檢測(cè)AML患者與MDS患者骨髓HC和MSC的熱點(diǎn)基因突變。結(jié)果:1.MSC的分離與鑒定:取第3代分離的貼壁細(xì)胞進(jìn)行鑒定。(1)經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),該貼壁細(xì)胞不表達(dá)HC的標(biāo)志抗原,如CD45和CD34;表達(dá)CD44、CD73、CD90和CD105。(2)誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)表明貼壁細(xì)胞可向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化,說明該貼壁細(xì)胞具有多向分化的潛能。(3)集落形成實(shí)驗(yàn)表明,單個(gè)貼壁細(xì)胞能夠增殖形成經(jīng)染色后肉眼可見的克隆單位,說明該貼壁細(xì)胞具有自我更新的干細(xì)胞特性。上述鑒定結(jié)果均符合國(guó)際治療學(xué)會(huì)(international Society for Cellular Therapy,ISCT)制定的鑒定MSC的最低標(biāo)準(zhǔn),因此可以認(rèn)為所分離純化的貼壁細(xì)胞為MSC。2.MSC的生物學(xué)特性:髓系腫瘤組(AML、MDS或CML患者)與健康供者(healthy donor,HD)對(duì)照組骨髓MSC在增殖能力、衰老細(xì)胞比例以及造血支持能力等三方面存在的差異。CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示:從第3-4d開始,髓系腫瘤組的增殖速度顯著低于對(duì)照組;但髓系腫瘤組內(nèi)無明顯差異。同樣,集落形成實(shí)驗(yàn)也表明,較HD組,髓系腫瘤組的增殖能力顯著降低,但各腫瘤組內(nèi)無明顯差異。HD、AML、MDS和CML的集落形成個(gè)數(shù)分別為:13.55±2.73、9.73±2.53、7.75±1.91與7.60±3.06。SA-β-Gal染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果為:第8代AML、MDS和CML骨髓MSC的衰老細(xì)胞占比分別為56.38±6.23%、53.75±14.66%和60.17±6.52%,顯著高于HD組的衰老細(xì)胞占比(23.14±4.18%)。可見,髓系腫瘤骨髓MSC較HD-MSC更容易衰老。將骨髓MSC與HD骨髓CD34~+HSC長(zhǎng)期共培養(yǎng),通過計(jì)數(shù)起始細(xì)胞數(shù)來評(píng)估MSC的造血支持能力。相比于對(duì)照組,與髓系腫瘤組MSC長(zhǎng)期共培養(yǎng)后的HD骨髓CD34~+HSC所形成的集落個(gè)數(shù)明顯減少。髓系腫瘤組的起始細(xì)胞數(shù)(CFU-GM、CFU-E和BFU-E集落個(gè)數(shù)總和)約為HD組的1/3,說明髓系腫瘤組MSC造血支持能力受損,但組內(nèi)無明顯差異。3.MSC的遺傳學(xué)特征:分析AML、MDS和CML患者骨髓MSC和HC的細(xì)胞遺傳學(xué)及熱點(diǎn)基因的突變情況以探究髓系腫瘤MSC與HC遺傳學(xué)特性及其關(guān)系。行CCA檢測(cè)29例AML患者骨髓HC和MSC的細(xì)胞核型,其中骨髓HC檢出異常核型的患者有16例,但在骨髓MSC中均未檢出細(xì)胞遺傳學(xué)異常。聯(lián)合CCA和FISH檢測(cè)37例MDS患者和15例CML患者骨髓MSC與HC的特異性位點(diǎn)的染色體異常。34例MDS患者骨髓HC培養(yǎng)成功、有分裂相,其中16例檢出核型異常;但骨髓MSC的細(xì)胞核型均未檢出異常;10例MDS患者骨髓HC經(jīng)FISH檢出5q-、7q-和+8等位點(diǎn)的改變,但其骨髓MSC的檢測(cè)結(jié)果也均為陰性。CML患者骨髓HC均檢出費(fèi)城染色體和bcr-abl融合基因,但骨髓MSC均未檢出。采用二代測(cè)序(next-generation sequencing,NGS)技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)AML和MDS骨髓HC和MSC熱點(diǎn)基因,發(fā)現(xiàn)送檢標(biāo)本的HC均檢出若干個(gè)基因突變,但是,僅有1例AML患者的MSC樣本檢出AXSL1基因突變。結(jié)論:密度梯度離心法聯(lián)合貼壁法分離MSC方法可靠,所提取的MSC具有干細(xì)胞特性,符合ISCT制定的定義MSC的最小鑒定標(biāo)準(zhǔn)。髓系腫瘤患者骨髓MSC生物學(xué)功能受損,表現(xiàn)為MSC增殖能力、自我更新能力和造血支持功能均減弱,具有明顯衰老傾向。遺傳學(xué)特征在髓系腫瘤患者骨髓MSC與骨髓HC之間無相關(guān)性。
【圖文】：

結(jié) 果細(xì)胞鑒定該部分研究所采用的細(xì)胞來自 HD 骨髓。原代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，懸浮與貼壁，經(jīng)過第 1 代和第 2 代的純化培養(yǎng)，直至第 3 代，懸浮細(xì)胞已完全去除壁生長(zhǎng)的梭形細(xì)胞可用于細(xì)胞鑒定。 細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物，結(jié)果顯示：貼壁細(xì)胞均不表達(dá) HC原，如 CD34 和 CD45；表達(dá) CD44、CD73、CD90 和 CD105，陽(yáng)性率均，符合 ISCT 制定的鑒定 MSC 的最低標(biāo)準(zhǔn)[19]。圖 1 展示的是 HD（N2，者 2 號(hào)）骨髓貼壁細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果：CD34 和 CD45 的陽(yáng)性表達(dá)為 0.9%和 044、CD73、CD90 和 CD105 的陽(yáng)性率分別為 99.8%、99.7%、99.2%和 99

2 多向分化能力鑒定對(duì)貼壁細(xì)胞行成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。其形態(tài)從纖胞樣的貼壁細(xì)胞分別逐漸分化成三種細(xì)胞形態(tài)：①成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)實(shí)，，細(xì)胞分化成富含鈣結(jié)節(jié)的成骨細(xì)胞（圖 2a），其鈣質(zhì)沉淀經(jīng)茜素紅媒染后紅色（圖 2g）；②成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞分化成聚集脂質(zhì)空脂肪細(xì)胞（圖 2b），中性脂肪滴經(jīng)油紅 O 染為橘紅色，胞質(zhì)經(jīng)蘇木素復(fù)染為（圖 2h）；③成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞分化成多角形的軟骨細(xì)圖 2c），其軟骨形成基質(zhì)經(jīng)阿利新藍(lán)染料染為藍(lán)色，而胞核不著色（圖 2i）照組的細(xì)胞染色后未見陽(yáng)性細(xì)胞（圖 2 d-f）。該部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本項(xiàng)目所的方法分離出的貼壁細(xì)胞具有多向分化的干細(xì)胞特性。成骨分化 成脂分化 成軟骨分化分化已
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R733;R730.43

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本文編號(hào)：2664388