【摘要】：癌癥,也稱為惡性腫瘤,是致死率極高的一類疾病。其難以治愈的原因在于癌細胞具有增殖失控、侵襲轉移的特點。在癌癥治療方面,常需要更早地提供一些與腫瘤發(fā)展相關的信息,以便于在對癌癥患者進行個體化治療,判斷患者的預后,在為易復發(fā)和高轉移危險的病例選擇適當?shù)妮o助治療時,可以提供有效的依據,從而提高患者的治愈率,生存率。隨著研究的不斷深入,研究者逐漸認識到腫瘤細胞內部基因、蛋白質和酶類等細胞分子間的相互通訊機制,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤細胞的浸潤、轉移和復發(fā)過程中起著重要作用,許多生物分子的變化常會導致失控的細胞增殖和凋亡,最終發(fā)生癌變。因此,研究相關生物分子的表達以及這些生物分子對癌細胞增殖、侵襲等活動的調控,將有助于開發(fā)新的靶向治療藥物,有利于腫瘤的個體化治療和預防。目前檢測這些生物分子的方法主要基于生物學方法,但這些方法存在操作繁瑣、破壞細胞結構等缺點,不能實時觀察生物分子的動態(tài)變化。因此,發(fā)展行之有效的方法在活細胞和活體水平上同時監(jiān)測多種生物分子的變化,有助于了解分子間通訊對細胞活動的調控作用,對療效評估及新藥篩選具有重要意義和實用價值!熒光成像分析法因具有快速、無損、可視化檢測等優(yōu)勢而成為可視化檢測活細胞和活體中生物分子的理想手段。近年來,隨著納米技術領域研究的不斷開展,納米熒光探針已經被廣泛應用于分析化學、生物學和醫(yī)學等相關領域。在這些納米材料中,金納米顆粒因其具有獨特的生物親和力和光學性質,在生物分子檢測、細胞和活體成像、癌癥檢測診斷等方面得到了極為廣泛的關注。目前大多數(shù)的研究只是對某些生物分子進行熒光成像,仍然缺乏對細胞分子間通訊進行可視化研究的手段。而通過成像檢測信號通路中的多個關鍵分子,可視化研究分子間通訊對細胞活動的相關調控更是一個巨大的挑戰(zhàn)。為了更好地理解癌癥的發(fā)展機制、細胞活動的調控機制以及更精準地評估癌癥的治療效果、更快捷可靠地篩選抗腫瘤新藥,發(fā)展一種熒光納米探針用于可視化研究細胞中多個生物分子對細胞活動的調控具有非常重要的意義和實用價值。本論文基于細胞中存在的miRNA、mRNA和蛋白酶等多種生物分子,利用金納米顆粒(AuNPs)、分子信標(MB)和肽鏈,設計合成了一系列不同的新型復合熒光納米探針,用于細胞內多種關鍵分子的同時可視化檢測,根據這些分子的熒光信號變化,研究了相關細胞性質和活動的變化,并以此進一步評估了藥物的療效。具體包括:1.基于AuNPs、MB和肽鏈,利用分步組裝的方式,將MB和肽鏈組裝到AuNPs表面,制備了一種多色熒光納米探針。AuNPs能有效猝滅修飾在MB和肽連上的染料的熒光。當兩種MBs遇到miR-221和PTEN mRNA靶標,肽鏈遇到MMP-9蛋白時,MBs的發(fā)夾結構打開,肽鏈被MMP-9切斷,從而導致熒光恢復。該探針通過同時可視化監(jiān)測PI3K/AKT通路中的miR-221,PTEN mRNA和MMP-9的表達變化,判斷細胞遷移和侵襲性質的變化。這種多色納米探針提供了一種簡單、無創(chuàng)、即時和直觀的方式對細胞遷移和侵襲進行研究,為進一步建立有效的靶向治療策略提供了有用的信息。2.構建了一種多色熒光納米探針。將MB和肽鏈分步組裝到AuNPs表面,MB和肽鏈上的染料的熒光會被AuNPs猝滅。當遇到增殖標志物Ki-67 mRNA和侵襲標志物uPA蛋白時,MB和肽鏈的結構被破壞,染料遠離AuNPs,熒光得以恢復,從而實現(xiàn)對這兩種標志物的同時檢測。該探針能夠對增殖標志物Ki-67 mRNA和侵襲標志物uPA蛋白進行同時檢測和成像,可視化研究了乳腺癌細胞和乳腺癌腫瘤經他莫西芬和姜黃素處理后癌細胞增殖和侵襲性質的變化,依據這些變化對兩種藥物療效進行了評估。該研究不但為癌細胞增殖失控、侵襲轉移提供了細胞和活體水平檢測的新方法,同時為抗腫瘤新藥的篩選及藥物的療效提供了一種快捷有效地新途徑。3.利用AuNPs、MB和肽鏈發(fā)展了一種復合熒光納米探針,該探針能夠在活細胞水平對EMT的上皮標志物E-cadherin mRNA、間質標志物vimentin mRNA和凋亡標志物Caspase-3進行同時可視化地檢測。MB被設計成莖環(huán)結構并修飾了熒光信號報告基團。在沒有靶分子出現(xiàn)時,MB上修飾的染料熒光會被AuNPs猝滅,當遇到E-cadherin mRNA和vimentin mRNA時,MB的莖環(huán)結構打開,染料遠離AuNPs,熒光得以恢復。將連接了熒光信號報告基團的肽鏈修飾到AuNPs,在Caspase-3存在時,肽鏈識別單元會被特異性切斷,末端染料被釋放并遠離AuNPs,從而使熒光得以恢復。因而所設計的熒光納米探針能夠實現(xiàn)對EMT和凋亡過程的同時檢測。根據二者間的關系,考察了不同癌細胞中EMT對凋亡的作用,并標定了 EMT對藥物療效的影響。該研究不但為腫瘤細胞EMT和凋亡的同時可視化檢測提供了新方法,而且為靶向EMT的腫瘤用藥療效評價提供了細胞水平檢測的新途徑。4.本文設計合成了一種新的Au-Se熒光納米探針,能夠對細胞信號通路中有上下游調控關系的侵襲標志物uPA和MMP-9兩種蛋白進行實時原位檢測。該探針是基于Au-Se鍵作用,在AuNPs上組裝了可特異性檢測uPA和MMP-9的兩種肽鏈,當遇到uPA和MMP-9蛋白時,肽鏈的結構被破壞,染料遠離AuNPs,熒光得以恢復,從而實現(xiàn)對這兩種蛋白的同時檢測。該探針特異性好,反應速度快。與以往制備的Au-S熒光納米探針相比,Au-Se探針具有更強的抗高含量GSH干擾的能力,能夠實時原位檢測兩種蛋白表達的先后順序,確定二者在信號通路中的上下游關系,上游的uPA能夠激活下游的MMP-9蛋白。本文所設計的Au-Se熒光納米探針能夠適用于復雜的生物體系,可以實現(xiàn)信號通路中上下游蛋白分子及調控關系的實時原位檢測,更為重要的是,該探針也為實時原位研究通路中其它信號分子及調控關系提供了新的思路。
【圖文】：

存在［７３１，是介于原子、分子以及宏觀體之間的一種過渡態(tài)，是一種含有有限原子逡逑的新物理形態(tài)。它具有獨特的物理化學性質，如表面效應、量子尺寸效應、小尺逡逑寸效應和精細可調的表面化學等［７３］（圖１－２）。目前已經發(fā)展了各種基于金納米逡逑顆粒的傳感器，這些傳感器被廣泛應用于生物檢測、生物電化學及生物醫(yī)學成像逡逑檢測等領域１７４，，７５］。首先，金納米顆粒易于制備可直接合成，而且制備的金納米顆逡逑粒在儲存數(shù)月后仍保持物理化學穩(wěn)定性。其次，金納米顆粒具有獨特的光學性質，逡逑１３逡逑

Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ邋Ｓｏｑｕｏｎｃｅ邋５邋？／＊ｖＡｖ，＼－ＳＨ－３逡逑（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ邋ＤＮＡ）逡逑圖１－６基于納米火焰探針用于檢測與轉移相關的ｍＲＮＡ靶標的示意圖逡逑為避免癌癥檢測中出現(xiàn)的假陽性結果，研究者一直致力于對多種腫瘤標志物逡逑進行同時檢測。唐波課題組基于ＡｕＮＰｓ和ＭＢｓ設計的熒光納米探針，實現(xiàn)了對逡逑細胞內兩種ｍＲＮＡｓ腫瘤標志物的同時檢測和成像［｜１２１。將兩個末端標記有染料逡逑的ＭＢｓ分子通過Ａｕ－Ｓ鍵作用修飾到ＡｕＮＰｓ表面，染料由于靠近ＡｕＮＰｓ而使熒逡逑光猝滅。當遇到相應的ｍＲＮＡ靶分子時，ＭＢｓ會與靶分子發(fā)生雜交反應，ＭＢｓ逡逑的莖環(huán)結構打開而使染料的熒光恢復，所制備的雙色熒光納米探針能夠對乳腺癌逡逑１９逡逑Ｉ逡逑
【學位授予單位】：山東師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R730.2;O657.3

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本文編號：2663008