【摘要】：嵌合抗原受體T(CAR-T)細(xì)胞療法已經(jīng)成為目前治療腫瘤的前沿技術(shù)之一,并且在治療血液腫瘤中獲得了突出的成果。目前已經(jīng)有兩項(xiàng)CAR-T產(chǎn)品在美國(guó)獲批上市。但CAR-T細(xì)胞在治療實(shí)體瘤方面亟待突破。開發(fā)針對(duì)新治療靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞依然是目前CAR-T治療的重要發(fā)展方向。AXL是腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的酪氨酸激酶受體,有可能成為實(shí)體腫瘤治療的潛在新靶點(diǎn)。本研究制備了靶向AXL的CAR-T細(xì)胞,并利用體內(nèi)外的模型,評(píng)價(jià)了AXL-CAR-T對(duì)實(shí)體腫瘤的治療作用。首先,我們?cè)O(shè)計(jì)并構(gòu)建了靶向AXL的第三代CAR分子慢病毒表達(dá)載體。它包含了一個(gè)全新的AXL抗體scFv結(jié)構(gòu)域的胞外段,IgG4鉸鏈區(qū)的跨膜段,以及由兩個(gè)共刺激區(qū)域(CD28胞內(nèi)段,4-1BB跨膜段和胞內(nèi)段)和一個(gè)CD3ζ基序組成的胞內(nèi)段。利用磷酸鈣沉淀法,將AXL-CAR慢病毒載體和包裝質(zhì)粒pMD2.G和psPAX2共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,獲得重組AXL-CAR慢病毒上清,并用超濾純化的方法,獲得了高滴度的重組AXL-CAR慢病毒。我們建立了CAR-T細(xì)胞制備的基本流程,獲得了高質(zhì)量的AXL-CAR-T細(xì)胞。主要包括:(1)從人的外周血淋巴細(xì)胞中分離T淋巴細(xì)胞;(2)T淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)和激活;(3)用AXL-CAR慢病毒感染T淋巴細(xì)胞獲得AXL-CAR-T細(xì)胞;(4)AXL-CAR-T細(xì)胞的體外擴(kuò)增;(5)CAR分子表達(dá)效率的檢測(cè)。為了更加敏感的檢測(cè)CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性,我們構(gòu)建了表達(dá)熒光素酶的多種腫瘤細(xì)胞株。利用熒光素酶(luc)過表達(dá)質(zhì)粒PLKO-cmv-luc包裝慢病毒,并感染靶細(xì)胞系MDA-MB-231,MCF-7,786-O,769-P,MiapacaII,Panc1,然后用嘌呤霉素篩選,獲得luc高表達(dá)的靶細(xì)胞株。對(duì)比傳統(tǒng)的Cr~(51)和LDH檢測(cè)法,熒光素酶工程化腫瘤細(xì)胞株能夠更加簡(jiǎn)單,準(zhǔn)確的用于檢測(cè)體外殺傷實(shí)驗(yàn)中靶細(xì)胞的存活率。為了評(píng)估AXL靶點(diǎn)在腫瘤治療中的臨床意義,我們也檢測(cè)了AXL在腎癌和乳腺癌病人樣本中的表達(dá)情況。在腎癌組織樣本中,腫瘤組織中AXL mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織,同時(shí)其配體GAS6的mRNA表達(dá)水平也顯著高于癌旁正常組織。在乳腺癌組織切片樣本中,AXL蛋白的表達(dá)水平也高于癌旁正常組織。特別是在三陰性乳腺癌中,AXL高表達(dá)的病例占到86%,顯著高于其他類型的乳腺癌。這些結(jié)果都提示AXL可以成為腫瘤治療的靶點(diǎn)。其次,我們將制備好的AXL-CAR-T細(xì)胞和luc表達(dá)的靶細(xì)胞系共培養(yǎng),檢測(cè)AXL-CAR-T細(xì)胞的體外殺傷效果。我們共制備了三個(gè)不同的AXL scFv克隆(L1,L7,3D3)的AXL-CAR-T細(xì)胞。其中,AXL-L7-CAR-T對(duì)于靶細(xì)胞系(786-O,769-P,MiapacaII,Panc1)的殺傷能力最強(qiáng)。因此,我們選取AXL-L7-CAR-T細(xì)胞作為后續(xù)研究的效應(yīng)細(xì)胞,后簡(jiǎn)稱AXL-CAR-T。相比于T細(xì)胞和對(duì)照Con-CAR-T細(xì)胞,AXL-CAR-T細(xì)胞對(duì)于AXL陽性的多種靶細(xì)胞系(MDA-MB-231、786-O、769-P、MiapacaII和Panc1)均有顯著的殺傷效果,且殺傷能力隨著效靶比的增大而增強(qiáng)。而對(duì)于AXL陰性的MCF-7細(xì)胞系,AXL-CAR-T的殺傷效果顯著減弱。這說明,AXL-CAR-T細(xì)胞的殺傷活性是AXL抗原特異性的。這種特異性的高效的細(xì)胞殺傷作用,是AXL-CAR-T細(xì)胞作為AXL陽性腫瘤臨床治療方法的基礎(chǔ)。最后,我們?cè)趧?dòng)物模型中,評(píng)價(jià)了AXL-CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤效果。我們選用B-NSG小鼠作為動(dòng)物模型,其重度免疫缺陷的表型,使其成為建立人源細(xì)胞移植模型的最佳選擇�？紤]到TNBC細(xì)胞系和患者中AXL的高表達(dá),以及TNBC患者亟需有效的治療方法,我們選用MDA-MB-231細(xì)胞系建立體內(nèi)動(dòng)物模型。我們將5×10~6的AXL陽性MDA-MB-231/luc細(xì)胞和基質(zhì)膠的混合物,種植于B-NSG小鼠皮下。十天后,所有小鼠全部荷瘤成功。將荷瘤小鼠分為三組,分別尾靜脈注射5×10~6的AXL-CAR-T細(xì)胞,T細(xì)胞和PBS,觀察腫瘤體積和小鼠體重的變化。對(duì)比T細(xì)胞治療組和PBS對(duì)照組,在AXL-CAR-T細(xì)胞治療的小鼠中,乳腺癌的體積和重量都得到了顯著的抑制。而T細(xì)胞治療組和PBS對(duì)照組相比,腫瘤的體積和重量都沒有顯著的差異。這些都證明了AXL-CAR-T細(xì)胞對(duì)AXL陽性腫瘤有靶向性的殺傷作用。在T細(xì)胞上表達(dá)AXL-CAR不僅賦予了T細(xì)胞靶向性,而且提高了T細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷能力。在對(duì)小鼠進(jìn)行細(xì)胞治療的過程中,我們?cè)诓煌臅r(shí)間點(diǎn)(治療后第2天和第12天)收集了小鼠的外周血,檢測(cè)其中T淋巴細(xì)胞的存續(xù)情況和CAR分子的表達(dá)效率。研究結(jié)果表明,治療后第2天,AXL-CAR-T細(xì)胞組和T細(xì)胞組中都能檢測(cè)到人源T細(xì)胞,說明尾靜脈模型的構(gòu)建成功。而治療后第14天,T細(xì)胞組中已經(jīng)檢測(cè)不到人源T細(xì)胞的存續(xù),而AXL-CAR-T細(xì)胞組依然能檢測(cè)到人源T細(xì)胞的存續(xù)。在AXL-CAR-T細(xì)胞治療組中,治療后第2天,人源T細(xì)胞中CAR分子的表達(dá)比例和輸注時(shí)的AXL-CAR-T細(xì)胞中的表達(dá)比例相似,證明了我們CAR-T細(xì)胞的制備和動(dòng)物模型的建立是成功的。治療后第12天,人源T細(xì)胞中幾乎找不到單純T細(xì)胞的存續(xù),擴(kuò)增的都是AXL-CAR-T細(xì)胞。這證明了CAR分子的表達(dá)提高了T細(xì)胞的存續(xù)能力。在治療終點(diǎn)時(shí),我們檢測(cè)了腫瘤浸潤(rùn)的人源T淋巴細(xì)胞,只有AXL-CAR-T細(xì)胞治療組中發(fā)現(xiàn)了大量人源T細(xì)胞的浸潤(rùn),而T細(xì)胞組和PBS組中均未發(fā)現(xiàn)。可見AXL-CAR分子的表達(dá),賦予了T細(xì)胞靶向性,使得CAR-T細(xì)胞能夠更好的存續(xù)并浸潤(rùn)到腫瘤組織中,發(fā)揮殺傷腫瘤的功能。綜上所述,我們建立了CAR-T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室制備的方法和利用熒光素酶工程化靶細(xì)胞檢測(cè)體外殺傷效應(yīng)的新方法。用全新的AXLscFv序列構(gòu)建了攜帶針對(duì)AXL的CAR慢病毒載體,包裝并制備了重組慢病毒。在此基礎(chǔ)上,我們制備了靶向AXL的CAR-T細(xì)胞。這種AXL-CAR-T細(xì)胞不僅能夠在體外特異性的殺傷AXL陽性的多種腫瘤細(xì)胞,而且能夠在體內(nèi)抑制AXL陽性腫瘤的生長(zhǎng)。本研究為AXL作為腫瘤治療的新靶點(diǎn),以及AXL-CAR-T作為實(shí)體腫瘤治療的新方法提供了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖表 10 乳腺癌病人樣本 AXL 免疫組化染色結(jié)果示意圖由圖 11 所示的 IOD 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果可見，，組織學(xué)分期越高的腫瘤中，達(dá)越高。說明，隨著乳腺癌的進(jìn)展，AXL 的蛋白表達(dá)升高。但是，由于樣沒有得到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R73-36

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本文編號(hào)：2662495