【摘要】：嵌合抗原受體T(CAR-T)細胞療法已經(jīng)成為目前治療腫瘤的前沿技術(shù)之一,并且在治療血液腫瘤中獲得了突出的成果。目前已經(jīng)有兩項CAR-T產(chǎn)品在美國獲批上市。但CAR-T細胞在治療實體瘤方面亟待突破。開發(fā)針對新治療靶點的CAR-T細胞依然是目前CAR-T治療的重要發(fā)展方向。AXL是腫瘤細胞高表達的酪氨酸激酶受體,有可能成為實體腫瘤治療的潛在新靶點。本研究制備了靶向AXL的CAR-T細胞,并利用體內(nèi)外的模型,評價了AXL-CAR-T對實體腫瘤的治療作用。首先,我們設(shè)計并構(gòu)建了靶向AXL的第三代CAR分子慢病毒表達載體。它包含了一個全新的AXL抗體scFv結(jié)構(gòu)域的胞外段,IgG4鉸鏈區(qū)的跨膜段,以及由兩個共刺激區(qū)域(CD28胞內(nèi)段,4-1BB跨膜段和胞內(nèi)段)和一個CD3ζ基序組成的胞內(nèi)段。利用磷酸鈣沉淀法,將AXL-CAR慢病毒載體和包裝質(zhì)粒pMD2.G和psPAX2共轉(zhuǎn)染293T細胞,獲得重組AXL-CAR慢病毒上清,并用超濾純化的方法,獲得了高滴度的重組AXL-CAR慢病毒。我們建立了CAR-T細胞制備的基本流程,獲得了高質(zhì)量的AXL-CAR-T細胞。主要包括:(1)從人的外周血淋巴細胞中分離T淋巴細胞;(2)T淋巴細胞體外培養(yǎng)和激活;(3)用AXL-CAR慢病毒感染T淋巴細胞獲得AXL-CAR-T細胞;(4)AXL-CAR-T細胞的體外擴增;(5)CAR分子表達效率的檢測。為了更加敏感的檢測CAR-T細胞對腫瘤細胞的殺傷活性,我們構(gòu)建了表達熒光素酶的多種腫瘤細胞株。利用熒光素酶(luc)過表達質(zhì)粒PLKO-cmv-luc包裝慢病毒,并感染靶細胞系MDA-MB-231,MCF-7,786-O,769-P,MiapacaII,Panc1,然后用嘌呤霉素篩選,獲得luc高表達的靶細胞株。對比傳統(tǒng)的Cr~(51)和LDH檢測法,熒光素酶工程化腫瘤細胞株能夠更加簡單,準確的用于檢測體外殺傷實驗中靶細胞的存活率。為了評估AXL靶點在腫瘤治療中的臨床意義,我們也檢測了AXL在腎癌和乳腺癌病人樣本中的表達情況。在腎癌組織樣本中,腫瘤組織中AXL mRNA表達水平明顯高于癌旁正常組織,同時其配體GAS6的mRNA表達水平也顯著高于癌旁正常組織。在乳腺癌組織切片樣本中,AXL蛋白的表達水平也高于癌旁正常組織。特別是在三陰性乳腺癌中,AXL高表達的病例占到86%,顯著高于其他類型的乳腺癌。這些結(jié)果都提示AXL可以成為腫瘤治療的靶點。其次,我們將制備好的AXL-CAR-T細胞和luc表達的靶細胞系共培養(yǎng),檢測AXL-CAR-T細胞的體外殺傷效果。我們共制備了三個不同的AXL scFv克隆(L1,L7,3D3)的AXL-CAR-T細胞。其中,AXL-L7-CAR-T對于靶細胞系(786-O,769-P,MiapacaII,Panc1)的殺傷能力最強。因此,我們選取AXL-L7-CAR-T細胞作為后續(xù)研究的效應細胞,后簡稱AXL-CAR-T。相比于T細胞和對照Con-CAR-T細胞,AXL-CAR-T細胞對于AXL陽性的多種靶細胞系(MDA-MB-231、786-O、769-P、MiapacaII和Panc1)均有顯著的殺傷效果,且殺傷能力隨著效靶比的增大而增強。而對于AXL陰性的MCF-7細胞系,AXL-CAR-T的殺傷效果顯著減弱。這說明,AXL-CAR-T細胞的殺傷活性是AXL抗原特異性的。這種特異性的高效的細胞殺傷作用,是AXL-CAR-T細胞作為AXL陽性腫瘤臨床治療方法的基礎(chǔ)。最后,我們在動物模型中,評價了AXL-CAR-T細胞的體內(nèi)抗腫瘤效果。我們選用B-NSG小鼠作為動物模型,其重度免疫缺陷的表型,使其成為建立人源細胞移植模型的最佳選擇�？紤]到TNBC細胞系和患者中AXL的高表達,以及TNBC患者亟需有效的治療方法,我們選用MDA-MB-231細胞系建立體內(nèi)動物模型。我們將5×10~6的AXL陽性MDA-MB-231/luc細胞和基質(zhì)膠的混合物,種植于B-NSG小鼠皮下。十天后,所有小鼠全部荷瘤成功。將荷瘤小鼠分為三組,分別尾靜脈注射5×10~6的AXL-CAR-T細胞,T細胞和PBS,觀察腫瘤體積和小鼠體重的變化。對比T細胞治療組和PBS對照組,在AXL-CAR-T細胞治療的小鼠中,乳腺癌的體積和重量都得到了顯著的抑制。而T細胞治療組和PBS對照組相比,腫瘤的體積和重量都沒有顯著的差異。這些都證明了AXL-CAR-T細胞對AXL陽性腫瘤有靶向性的殺傷作用。在T細胞上表達AXL-CAR不僅賦予了T細胞靶向性,而且提高了T細胞對腫瘤的殺傷能力。在對小鼠進行細胞治療的過程中,我們在不同的時間點(治療后第2天和第12天)收集了小鼠的外周血,檢測其中T淋巴細胞的存續(xù)情況和CAR分子的表達效率。研究結(jié)果表明,治療后第2天,AXL-CAR-T細胞組和T細胞組中都能檢測到人源T細胞,說明尾靜脈模型的構(gòu)建成功。而治療后第14天,T細胞組中已經(jīng)檢測不到人源T細胞的存續(xù),而AXL-CAR-T細胞組依然能檢測到人源T細胞的存續(xù)。在AXL-CAR-T細胞治療組中,治療后第2天,人源T細胞中CAR分子的表達比例和輸注時的AXL-CAR-T細胞中的表達比例相似,證明了我們CAR-T細胞的制備和動物模型的建立是成功的。治療后第12天,人源T細胞中幾乎找不到單純T細胞的存續(xù),擴增的都是AXL-CAR-T細胞。這證明了CAR分子的表達提高了T細胞的存續(xù)能力。在治療終點時,我們檢測了腫瘤浸潤的人源T淋巴細胞,只有AXL-CAR-T細胞治療組中發(fā)現(xiàn)了大量人源T細胞的浸潤,而T細胞組和PBS組中均未發(fā)現(xiàn)。可見AXL-CAR分子的表達,賦予了T細胞靶向性,使得CAR-T細胞能夠更好的存續(xù)并浸潤到腫瘤組織中,發(fā)揮殺傷腫瘤的功能。綜上所述,我們建立了CAR-T細胞實驗室制備的方法和利用熒光素酶工程化靶細胞檢測體外殺傷效應的新方法。用全新的AXLscFv序列構(gòu)建了攜帶針對AXL的CAR慢病毒載體,包裝并制備了重組慢病毒。在此基礎(chǔ)上,我們制備了靶向AXL的CAR-T細胞。這種AXL-CAR-T細胞不僅能夠在體外特異性的殺傷AXL陽性的多種腫瘤細胞,而且能夠在體內(nèi)抑制AXL陽性腫瘤的生長。本研究為AXL作為腫瘤治療的新靶點,以及AXL-CAR-T作為實體腫瘤治療的新方法提供了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖表 10 乳腺癌病人樣本 AXL 免疫組化染色結(jié)果示意圖由圖 11 所示的 IOD 統(tǒng)計分析結(jié)果可見，，組織學分期越高的腫瘤中，達越高。說明，隨著乳腺癌的進展，AXL 的蛋白表達升高。但是，由于樣沒有得到統(tǒng)計學差異。
【學位授予單位】：軍事科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R73-36

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本文編號：2662495