【摘要】：目的:結(jié)直腸癌是最常見的癌癥類型之一,其發(fā)病率占惡性腫瘤總數(shù)的9%,并且有每年增加的趨勢。miRNA在哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在,參與到細(xì)胞生長、分化、凋亡等多個(gè)過程,目前對(duì)其的研究很多,可以作為腫瘤潛在的診斷和治療靶點(diǎn),已有多項(xiàng)研究探討miRNA和結(jié)直腸癌及其基因的分子機(jī)制,已知miR-92b-3p在結(jié)直腸癌細(xì)胞和組織中都有異常高水平的表達(dá),但是miR-92b-3p與結(jié)直腸癌的關(guān)系,以及在其中的作用機(jī)制報(bào)道很少。方法:第一部分:1.利用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測mi R-92b-3p inhibitor處理結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和HT29細(xì)胞增殖能力以及克隆形成能力的變化;2.miR-92b-3p inhibitor處理的各組細(xì)胞,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞細(xì)胞周期比例變化,以及各組細(xì)胞凋亡水平的變化;3.mi R-92b-3p inhibitor處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后,采用transwell方法對(duì)細(xì)胞的遷移和侵襲能力進(jìn)行檢測。第二部分:1.利用生物信息學(xué)技術(shù)和公共數(shù)據(jù)庫miRBase和TargetScan進(jìn)行miRNA序列匹配,預(yù)測miR-92b-3p的作用靶標(biāo)基因;2.利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)對(duì)miR-92b-3p及其作用靶標(biāo)基因FBXW7的相互作用關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證;3.設(shè)計(jì)并構(gòu)建過表達(dá)FBXW7的pcDNA3.0載體,轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測FBXW7過表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和HT29細(xì)胞增殖以及克隆形成能力的影響;4.在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中過表達(dá)FBXW7,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞細(xì)胞周期比例以及凋亡水平的變化;5.在結(jié)直腸癌細(xì)胞中過表達(dá)FBXW7后,利用Transwell實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞的遷移和侵襲能力改變進(jìn)行檢測。第三部分:1.建立細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組:blank組、inhibitor組、inhibitor+siFBXW7組和NC組,進(jìn)行下游功能實(shí)驗(yàn);利用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測miR-92b-3p和FBXW7對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和HT29細(xì)胞增殖能力以及克隆形成能力的影響;2.流式細(xì)胞術(shù)檢測四組細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡情況細(xì)胞改變;3.transwell實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變;第四部分:建立了移植瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?記錄裸鼠體內(nèi)腫瘤大小,繪制生長曲線,HE染色鑒定腫瘤組織病理學(xué)特征;結(jié)果:第一部分:1.相對(duì)于正常結(jié)直腸組織細(xì)胞,miR-92b-3p在結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和HT29中表達(dá)水平異常增高,抑制miR-92b-3p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長和克隆形成能力有顯著抑制作用(p0.05);2.抑制miR-92b-3p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期具有阻遏作用,更高比例的細(xì)胞被阻遏在了G0/G1期,S期細(xì)胞比例減少(p0.05);抑制mi R-92b-3p提高了結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡水平;3.抑制miR-92b-3p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力具有阻遏作用(p0.05)。第二部分:1.信息學(xué)預(yù)測認(rèn)為FBXW7是miR-92b-3p的直接作用靶標(biāo)基因之一,雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明了二者的直接作用關(guān)系;2.在HCT116和HT29兩株結(jié)直腸癌細(xì)胞系中過表達(dá)FBXW7,過表達(dá)組癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力明顯低于對(duì)照組(p0.05);3.在HCT116和HT29兩株結(jié)直腸癌細(xì)胞系中過表達(dá)FBXW7,相對(duì)于對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期明顯被阻遏于G0/G1期,同時(shí)S期細(xì)胞比例下降(p0.05);而相對(duì)應(yīng)的癌細(xì)胞的凋亡水平有明顯上升(p0.05);4.在HCT116和HT29兩株結(jié)直腸癌細(xì)胞系中過表達(dá)FBXW7,相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力被顯著抑制(p0.05)。第三部分:1.經(jīng)過miR-92b-3p inhibitor處理后,相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖和克隆形成能力有了明顯被抑制,而inhibitor+siFBXW7處理組細(xì)胞的增殖和克隆能力有了部分恢復(fù)(p0.05);2.在細(xì)胞周期與凋亡實(shí)驗(yàn)中,相對(duì)于對(duì)照組,通過miR-92b-3p inhibitor處理的細(xì)胞系細(xì)胞周期能力有了明顯被抑制在G0/G1的趨勢,S期細(xì)胞比例下降,進(jìn)入凋亡的細(xì)胞比例明顯上升。而inhibitor+siFBXW7處理組細(xì)胞的周期和凋亡水平都有了部分恢復(fù)(p0.05);3.在transwell實(shí)驗(yàn)中,miR-92b-3p inhibitor處理后細(xì)胞其遷移和侵襲能力明顯被抑制,inhibitor+siFBXW7處理組細(xì)胞的遷移和侵襲能力有了部分恢復(fù)(p0.05);第四部分:1.在裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)mi R-92b-3p inhibitor組的裸鼠瘤體大小明顯比對(duì)照組裸鼠瘤體更小,而inhibitor+siFBXW7組抵消了瘤體縮小的效果,裸鼠瘤體有所恢復(fù)。2.組織病理學(xué)切片進(jìn)行鏡下觀察時(shí),發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照組,miR-92b-3p inhibitor組的腫瘤組織結(jié)構(gòu)被明顯抑制,而inhibitor+siFBXW7組的癌組織得到了很大程度的恢復(fù)。結(jié)論:在結(jié)直腸癌中高水平的表達(dá)的mi R-92b-3p能夠靶向性抑制FBXW7表達(dá)水平,導(dǎo)致癌細(xì)胞獲得更高的增殖能力和抗凋亡能力。低水平的miR-92b-3p能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力并誘導(dǎo)其細(xì)胞發(fā)生凋亡,這可能是由于FBXW7表達(dá)水平得到升高而引起的;這是第一次關(guān)于在結(jié)直腸癌中miR-92b-3p與FBXW7相互作用并影響癌細(xì)胞生物學(xué)功能的報(bào)道,相關(guān)結(jié)果在裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也得到了證明,揭示mi R-92b-3p具有原癌基因功能的分子機(jī)制。
【圖文】：

15 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組數(shù)據(jù)間比較采用 t 檢驗(yàn)、多t-hoc 分析，兩組以上數(shù)據(jù)間比較采用 One-Way ANOV顯著差異。-3p 在結(jié)直腸癌組織與細(xì)胞系中的表達(dá)及意義腸癌細(xì)胞株 HT29，HCT116 以及 FHC 人正常結(jié)直腸胞內(nèi) miR-92b-3p 表達(dá)水平進(jìn)行 RT-PCR 分析，發(fā)現(xiàn)系 HT29、HCT116 和人正常結(jié)直腸粘膜細(xì)胞 FHC 中 和 HCT116 這兩個(gè)結(jié)直腸癌細(xì)胞株中，miR-92b-3p 的圖 1.1)。

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文2.2 敲減 miR-92b-3p 抑制 HT29 和 HCT116 細(xì)胞增殖能力為了觀察 miR-92b-3p 是否影響到結(jié)直腸癌細(xì)胞株 HT29 和 HCT116 的生物學(xué)行為和功能，我們分別在結(jié)直腸癌細(xì)胞系 HT29、HCT116 中利用 miR-92b-3pinhibitor 處理,比較處理前后的細(xì)胞增殖和克隆形成能力，發(fā)現(xiàn)處理組的 HT29、HCT116 細(xì)胞增殖和克隆形成能力明顯降低，，明顯低于未處理組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 1.2）。該結(jié)果提示敲減 miR-92-3p 能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞 HT29 和HCT116 的克隆形成能力。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.34

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2661511