發(fā)布時間：2020-05-13 04:15

【摘要】：研究背景:乳腺癌患者好發(fā)骨轉(zhuǎn)移,骨轉(zhuǎn)移可引起多種骨的并發(fā)癥,嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和生存期,闡明乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制有助于發(fā)現(xiàn)預(yù)測骨轉(zhuǎn)移風(fēng)險和治療骨轉(zhuǎn)移的新策略。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子F2(forkhead box F2,FOXF2)是調(diào)控胚胎發(fā)育和組織分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,特異性表達(dá)在間質(zhì)細(xì)胞中,通過促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞分化和抑制鄰近上皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化維持組織穩(wěn)態(tài)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)FOXF2在乳腺原發(fā)癌組織中與一組骨及骨基質(zhì)重塑相關(guān)基因異位共表達(dá),且FOXF2高表達(dá)的乳腺癌患者骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率高,提示FOXF2異位高表達(dá)促進(jìn)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究FOXF2調(diào)控乳腺癌骨轉(zhuǎn)移可能的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)骨及骨基質(zhì)重塑關(guān)鍵信號分子骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)中BMP4是潛在的FOXF2調(diào)控靶分子。因此,我們推測FOXF2可能通過調(diào)控BMPs信號通路促進(jìn)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移。目的:本研究旨在闡明FOXF2在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中的作用及分子機(jī)制,以期發(fā)現(xiàn)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移風(fēng)險預(yù)測的分子診斷方法和靶向治療骨轉(zhuǎn)移的新策略。研究方法:1.基于課題組和公共數(shù)據(jù)庫中乳腺原發(fā)癌組織的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù),Pearson’s方法分析與FOXF2呈相關(guān)性表達(dá)的基因(r≥0.3);RT-QPCR方法檢測乳腺原發(fā)癌組織中FOXF2與骨及骨基質(zhì)重塑相關(guān)基因m RNA表達(dá),驗證FOXF2與骨及骨基質(zhì)重塑相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性;Kplan-Meier和Log-rank方法分析FOXF2和BMP4 m RNA表達(dá)水平與患者骨轉(zhuǎn)移生存的關(guān)系;K均值聚類比較發(fā)生骨轉(zhuǎn)移與非骨轉(zhuǎn)移原發(fā)癌、及骨轉(zhuǎn)移癌與其它器官轉(zhuǎn)移癌中與FOXF2相關(guān)性表達(dá)的骨及骨基質(zhì)重塑相關(guān)基因的平均表達(dá)水平。2.分別在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7中瞬時轉(zhuǎn)染含F(xiàn)OXF2 c DNA全長的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pc DNA3.1-HA-FOXF2(FOXF2-HA)和對照質(zhì)粒(Vector)、或者在MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染特異性靶向FOXF2的si RNA(small intreference RNA;si FOXF2)和對照si RNA(si Control),使乳腺癌細(xì)胞過表達(dá)外源性FOXF2或沉默內(nèi)源性FOXF2表達(dá)。用成骨樣骨肉瘤細(xì)胞MG-63或正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)癌細(xì)胞,檢測乳腺癌細(xì)胞在體外模擬的骨/肺微環(huán)境中趨化遷移、異質(zhì)粘附和克隆形成能力;用癌細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠成骨前體細(xì)胞MC3T3E1和破骨前體細(xì)胞,檢測癌細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化能力,western blot檢測癌細(xì)胞中骨及骨基質(zhì)重塑相關(guān)蛋白、破骨細(xì)胞分化相關(guān)因子以及被誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞中與成骨細(xì)胞分化相關(guān)的分子標(biāo)志物表達(dá)。3.結(jié)合文獻(xiàn)報道,從成骨分化和骨重塑誘導(dǎo)因子編碼基因中,篩選出BMP4為候選的FOXF2調(diào)控的下游靶基因;RT-QPCR和western blot方法檢測FOXF2對乳腺癌細(xì)胞中BMP4表達(dá)水平的影響;Western blot和免疫熒光方法檢測BMP信號通路下游效應(yīng)分子p-Smad1(phospho-Smad1)的表達(dá)和核定位狀態(tài)。4.采用BMP4生長因子誘導(dǎo)沉默內(nèi)源性FOXF2表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞中的BMP信號通路,或者用BMP信號通路抑制劑noggin(NOG)封閉過表達(dá)外源性FOXF2的乳腺癌細(xì)胞中的BMP信號通路,檢測癌細(xì)胞在體外模擬的骨/肺微環(huán)境中趨化遷移、異質(zhì)粘附和克隆形成及誘導(dǎo)小鼠破骨前體細(xì)胞分化能力;RT-QPCR和western blot檢測癌細(xì)胞中骨及骨基質(zhì)重塑相關(guān)基因m RNA和蛋白表達(dá),從而確定BMP4對FOXF2調(diào)控的體外乳腺癌細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移潛能的介導(dǎo)作用。5.基于公共數(shù)據(jù)庫乳腺癌組織基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)中FOXF2和BMP4 m RNA表達(dá)水平,分析FOXF2和BMP4 m RNA水平在單純骨轉(zhuǎn)移與非骨轉(zhuǎn)移的乳腺癌原發(fā)癌組織、以及骨轉(zhuǎn)移癌與其它臟器轉(zhuǎn)移癌組織的表達(dá)差異;Kplan Meier生存曲線和Log-rank分析FOXF2和BMP4 m RNA水平單獨和聯(lián)合與乳腺癌患者BMFS的關(guān)系。結(jié)果:1.在乳腺原發(fā)癌組織中,FOXF2與一組骨及骨基質(zhì)重塑相關(guān)基因成正相關(guān)性表達(dá);RT-QPCR結(jié)果證實在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的乳腺原發(fā)癌組織中FOXF2 m RNA高表達(dá)在總的(n=33,P=0.05)、Luminal亞型(n=21,P=0.06)和三陰性亞型病例中BMFS均差于低表達(dá)組(n=12,P=0.02);FOXF2 m RNA與ITGBL1和POSTN m RNA表達(dá)成正相關(guān);公共數(shù)據(jù)庫中,FOXF2 m RNA與ITGBL1、POSTN、RUNX2 m RNA表達(dá)成正相關(guān),FOXF2 m RNA高表達(dá)的乳腺癌患者BMFS縮短;K均值聚類分析顯示FOXF2聯(lián)合骨及骨基質(zhì)重塑相關(guān)基因m RNA高表達(dá)的乳腺癌患者易發(fā)生單純骨轉(zhuǎn)移,且其表達(dá)量在骨轉(zhuǎn)移灶較高。2.過表達(dá)外源性FOXF2增強(qiáng)MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞在模擬的骨微環(huán)境中的趨化、粘附、錨定非依賴性克隆形成及誘導(dǎo)小鼠破骨前體細(xì)胞分化能力,而降低MDA-MB-231細(xì)胞在模擬肺微環(huán)境中的趨化和克隆形成能力,對MCF-7細(xì)胞無影響;相反,沉默內(nèi)源性FOXF2表達(dá)降低MDA-MB-231細(xì)胞在模擬的骨微環(huán)境中的趨化、粘附、錨定非依賴性克隆形成及誘導(dǎo)小鼠破骨前體細(xì)胞分化能力,而增強(qiáng)在模擬的肺微環(huán)境中細(xì)胞的趨化和克隆形成能力;乳腺癌細(xì)胞中骨及骨基質(zhì)重塑相關(guān)蛋白、破骨細(xì)胞分化相關(guān)因子及被誘導(dǎo)成骨分化標(biāo)志分子在過表達(dá)外源性FOXF2的細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),在沉默內(nèi)源性FOXF2表達(dá)的細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。3.在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中,FOXF2正向調(diào)節(jié)BMP4m RNA和蛋白表達(dá)水平、以及p-Smad1水平;沉默F(xiàn)OXF2表達(dá)使Smad1的細(xì)胞核表達(dá)量降低。4.在沉默F(xiàn)OXF2表達(dá)的MDA-MB-231中施加BMP4生長因子刺激,可部分恢復(fù)沉默F(xiàn)OXF2表達(dá)導(dǎo)致的細(xì)胞在模擬的骨微環(huán)境中的趨化遷移、粘附、克隆生長及誘導(dǎo)小鼠破骨前體細(xì)胞分化能力,上調(diào)降低的骨基質(zhì)重塑相關(guān)蛋白表達(dá),而對模擬肺微環(huán)境趨化和克隆生長能力無明顯影響;相反在過表達(dá)外源性FOXF2的乳腺癌細(xì)胞MCF-7中施加NOG阻斷BMP4與其受體結(jié)合,部分減弱了由過表達(dá)外源性FOXF2導(dǎo)致的細(xì)胞在模擬的骨微環(huán)境中的惡性生物學(xué)行為,上調(diào)的骨及骨基質(zhì)m RNA和蛋白表達(dá)下降,而對模擬肺微環(huán)境中的趨化和克隆生長能力影響無顯著影響。5.FOXF2與BMP4 m RNA在乳腺原發(fā)癌組織中呈正相關(guān)性表達(dá)(n=327,P=0.01);發(fā)生單純骨轉(zhuǎn)移的乳腺癌原發(fā)癌組織(n=61)中BMP4表達(dá)水平高于其它臟器轉(zhuǎn)移的非骨轉(zhuǎn)移(n=307)的乳腺癌組織(P=0.05);骨轉(zhuǎn)移癌組織(n=18)中BMP4表達(dá)水平高于其它器官轉(zhuǎn)移癌組織(n=47,P=0.05);BMP4 m RNA高表達(dá)的乳腺癌患者BMFS低于低表達(dá)患者(n=368,P=0.045);FOXF2聯(lián)合BMP4 m RNA高表達(dá)組乳腺癌患者BMFS低于其他組(n=368,P=0.022)。結(jié)論:1.FOXF2與一組骨及骨基質(zhì)重塑相關(guān)基因在乳腺癌組織中呈異位共表達(dá)。FOXF2通過上調(diào)骨及骨基質(zhì)重塑相關(guān)蛋白表達(dá),使乳腺癌細(xì)胞獲得骨擬態(tài)表型。2.臨床病例研究、體外細(xì)胞學(xué)實驗證實,FOXF2異位高表達(dá)促進(jìn)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移。3.BMP4為FOXF2調(diào)控的靶基因;FOXF2上調(diào)BMP4表達(dá),通過自分泌作用促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞高表達(dá)骨及骨基質(zhì)重塑相關(guān)基因,形成骨擬態(tài)表型,進(jìn)而促進(jìn)其在特異性在骨微環(huán)境中的趨化遷移、定植、克隆性增殖以及促進(jìn)破骨細(xì)胞分化;因而,FOXF2可能通過上調(diào)BMP4表達(dá)促進(jìn)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移潛能。4.FOXF2和BMP4 m RNA在發(fā)生單純骨轉(zhuǎn)移的乳腺原發(fā)癌組織中高表達(dá),是乳腺癌骨轉(zhuǎn)移預(yù)測分子標(biāo)志物,二者聯(lián)合較單獨應(yīng)用可更好地預(yù)測乳腺癌患者骨轉(zhuǎn)移風(fēng)險。
【圖文】：

蛋白（ASPN、COMP、CSPG2、DSPG3、OGN、OSF-2、SPARC、ITG 等）、骨基質(zhì)蛋白酶（CTSK，ADAM12），成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子（RUN胞鈣粘素（CDH11），骨基質(zhì)重塑相關(guān)生長因子（DACT1、DKK3、 1.1 A）。利用基于基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)建立的乳腺癌在線預(yù)測工具 GO詢?nèi)橄侔┲信c FOXF2 成正相關(guān)性表達(dá)的基因（r ≥ 0.3），從中篩選與重塑相關(guān)的基因，得到 39 個常見的骨和骨基質(zhì)重塑相關(guān)基因，其中與實驗室芯片數(shù)據(jù)篩選得到的骨和骨基質(zhì)重塑相關(guān)基因相同。

其中 39 個骨和骨基質(zhì)重塑相關(guān)基因中，紅色字體顯示是 A）和 B基因 31 個，黑色字體表示兩者不相同的基因 8 個。.2 FOXF2 mRNA 表達(dá)量在乳腺原發(fā)癌組織中與骨和骨基質(zhì)重塑相關(guān)基性驗證RT-QPCR 技術(shù)分別檢測 305 例和 62 例乳腺原發(fā)癌組織中 FOXF2、IOSTN mRNA 表達(dá)水平，Perason 相關(guān)性分析 FOXF2 mRNA 與量之間結(jié)果顯示在原發(fā)癌組織中 FOXF2 mRNA 表達(dá)水平與 ITGBL1（P < 0OSTN（P = 0.004）mRNA 水平均成正相關(guān)性表達(dá)（圖 1.2 A）。進(jìn)一原發(fā)癌組織基因芯片公共數(shù)據(jù)庫 GSE20685[44]驗證上述基因表達(dá)相327例乳腺原發(fā)癌組織中，，F(xiàn)OXF2與ITGBL1（P < 0.001）、POSTN（P <UNX2（P < 0.001）mRNA 表達(dá)水平也成正相關(guān)性（圖 1.2 B），提示 轉(zhuǎn)錄因子可能對乳腺原發(fā)癌中的骨和骨基質(zhì)重塑相關(guān)基因存在潛在關(guān)系。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孔學(xué);賈英杰;劉宏根;;中藥聯(lián)合雙磷酸鹽治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展[J];名醫(yī);2018年05期

2 畢迎惠;宮帥;陳偉;;晚期乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者臨床病理特征及預(yù)后生存分析[J];中國臨床研究;2018年11期

3 聶曉;王峻;甄俊平;;乳腺癌骨轉(zhuǎn)移影像學(xué)檢查的現(xiàn)狀與展望[J];中國藥物與臨床;2016年12期

4 吳玲;王佳;吳英;夏添松;;乳腺癌骨轉(zhuǎn)移過程中的分子機(jī)制[J];中國腫瘤外科雜志;2017年01期

5 賀丹;付波;王敏;;乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者放療后的預(yù)后分析[J];中國腫瘤臨床與康復(fù);2017年04期

6 岳偉;葉麗紅;;滋腎壯骨法治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移[J];吉林中醫(yī)藥;2017年05期

7 王坤英;;血脂水平與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生的相關(guān)性研究[J];中國藥物與臨床;2017年07期

8 趙春明;翟嵩超;楊鶴;;血清腫瘤標(biāo)志物預(yù)測乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的臨床價值分析[J];中國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理;2017年18期

9 黃海福;;獨活寄生湯對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者骨相關(guān)事件的影響[J];中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志;2017年09期

10 羅興訓(xùn);張燕;朱軍;陳琴華;;中藥治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究進(jìn)展[J];山西醫(yī)藥雜志;2015年23期

相關(guān)會議論文 前10條

1 張媛;馮利;;乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的術(shù)后輔助化學(xué)治療之中西進(jìn)展[A];2009年首屆全國中西醫(yī)腫瘤博士及中青年醫(yī)師論壇論文集[C];2009年

2 程晶;;乳腺癌骨轉(zhuǎn)移和骨相關(guān)疾病臨床診療專家共識(2010版)[A];湖北省第21屆腫瘤學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2011年

3 郭保鳳;劉勝;;乳腺癌骨轉(zhuǎn)移動物模型的建立及中藥對其研究相關(guān)進(jìn)展[A];2011年中醫(yī)外科學(xué)術(shù)年會論文集[C];2011年

4 孫

本文編號：2661371