發(fā)布時(shí)間：2020-05-12 02:25

【摘要】：原發(fā)性肝癌位于惡性腫瘤死亡率前列,具有發(fā)病率高,不易發(fā)現(xiàn),病情發(fā)展迅速等特點(diǎn),是現(xiàn)代分子細(xì)胞生物學(xué),醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。KDM5C(JARID1C or SMCX)屬于組蛋白去甲基化酶家族,位于X染色體,含有一個(gè)ARID結(jié)構(gòu)域,一個(gè)JmjC結(jié)構(gòu)域,一個(gè)JmjN結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)PHD型鋅指的蛋白質(zhì),其中JmjC結(jié)構(gòu)域主要發(fā)揮特異性去除H3K4me3的甲基殘基的功能,而H3K4me3是一個(gè)重要的組蛋白修飾marker,可以影響其他基因的轉(zhuǎn)錄激活。本課題通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了KDM5C在人肝癌及癌旁組織的表達(dá),結(jié)果顯示相對(duì)于癌旁組織,KDM5C在肝癌組織中的表達(dá)上調(diào)。蘇木精伊紅(HE)染色和免疫組化的結(jié)果顯示,KDM5C基因在肝癌組織的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá),但主要集中于細(xì)胞核內(nèi)。為研究KDM5C在肝癌細(xì)胞中的功能,本文利用CRISPR/Cas9對(duì)KDM5C進(jìn)行了敲除并建立了穩(wěn)定的細(xì)胞系。首先利用CRISPR/Cas9的靶點(diǎn)設(shè)計(jì)網(wǎng)站進(jìn)行KDM5C敲除位點(diǎn)的設(shè)計(jì)選擇,隨后將構(gòu)建好的靶點(diǎn)連入pX458載體,轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞,利用有限稀釋法建立KDM5C敲除細(xì)胞系(KDM5C-KO)并通過測(cè)序和Western Blot進(jìn)行了敲除驗(yàn)證。其次本論文研究了KDM5C對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。MTT增殖和克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,KDM5C敲除顯著抑制了肝癌細(xì)胞HepG2的增殖和克隆形成;PI染色發(fā)現(xiàn)KDM5C敲除后,細(xì)胞S期比例下降,細(xì)胞增殖受到抑制;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)KDM5C敲除促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的凋亡;細(xì)胞劃痕和Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明KDM5C敲除顯著抑制了細(xì)胞遷移侵襲能力。綜上所述,本研究分析了KDM5C在肝癌中的表達(dá)及定位,通過CRISPR/Cas9進(jìn)行KDM5C敲除并建立了穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除細(xì)胞系。KDM5C基因敲除顯著抑制了肝癌細(xì)胞增殖,遷移,侵襲,克隆形成,以上結(jié)果表明KDM5C通過促進(jìn)腫瘤的發(fā)生在肝癌細(xì)胞中發(fā)揮功能。
【圖文】：

-3-圖 1-2 不同甲基化水平的精氨酸結(jié)構(gòu) 組蛋白去甲基化酶組蛋白去甲基化酶，，顧名思義是可以脫去組蛋白甲基化的一類酶，主 類和 jumonji 類[6]。哈佛醫(yī)學(xué)院的施楊教授在 2004 年發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)組化酶[4]，賴氨酸特異性的去甲基化酶 1（LSD1)。LSD1 是一個(gè) FAD 依酶，它能夠特異性脫去單甲基化和二甲基化的組蛋白賴氨酸殘基上的隨著表觀遺傳學(xué)的興起，發(fā)現(xiàn)了更多的組蛋白脫甲基化酶家族，從作分兩種主要的組蛋白去甲基化酶：黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依賴性 Fe2+與 α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶。二者作用機(jī)理如圖 1-3 所示[8]。從我們可以看出前者只能催化一甲基或二甲基基團(tuán)，而不能去掉賴氨酸

圖 1-3 兩種組蛋白去甲基化酶作用機(jī)理（上部為 FAD 依賴性，下部為 α-酮戊二酸依賴性）但是后者就不需要這個(gè) N 上的質(zhì)子參與反應(yīng)，因此三個(gè)甲基化修飾都可以被去掉。這第二類含有 JmjC 結(jié)構(gòu)域的去甲基化酶是由北卡羅來納大學(xué)的張毅教授于2007 年發(fā)現(xiàn)。研究表明，JmjC 結(jié)構(gòu)域在空間上形成 8 個(gè) β 折疊，能夠結(jié)合二價(jià)亞鐵離子和 α-酮戊二酸[8]。從而滿足 Fe2+與 α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶催化賴氨酸三甲基化的去除的條件，可以相應(yīng)的影響端粒的長(zhǎng)度，是作為表觀遺傳修飾的重要途徑，可能調(diào)控機(jī)體增殖，衰老，腫瘤發(fā)生等重要生物學(xué)過程。1.3 KDM5C 及其研究進(jìn)展1.3.1 KDM5C 概述KDM5C (JARID1C)，英文名 Lysine (K)-specific demethylase 5C，中文名賴氨酸特異性去甲基化酶 5C，位于 X 染色體上。 KDM5C 是蛋白質(zhì)編碼基因，編碼 1560
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 馬潔稚;組蛋白H3K4甲基化水平及特異性修飾酶在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)研究[D];中南大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2659476