【摘要】：研究背景及目的慢性粒細(xì)胞性白血病(CML),簡稱慢粒,與造血干細(xì)胞的染色體異常有關(guān),最典型的是費(fèi)城染色體長臂上9號染色體與22號染色體的易位,這種易位導(dǎo)致BCR-ABL融合基因的產(chǎn)生,同時產(chǎn)生大量的BCR-ABL融合蛋白,同時酪氨酸激酶被異常激活。BCR-ABL可以改變骨髓祖細(xì)胞,并且驅(qū)動95%慢性粒性細(xì)胞白血病(CML)病例的發(fā)展。BCR-ABL通過激活能夠提高細(xì)胞增殖和生存的下游通路來促進(jìn)慢性粒細(xì)胞白血病的發(fā)展,這些通路包括RAF/MEK/ERK、PI3K/AKT、JAK/STAT等。慢粒的臨床分期是:慢性期、加速期、急變期。伊馬替尼作為CML和其他表達(dá)BCR-ABL的白血病的一線臨床用藥,它可以與ABL激酶位點(diǎn)結(jié)合,進(jìn)而抑制其底物磷酸化,大部分病人用伊馬替尼治療后,他們在疾病的慢性階段獲得了完整的細(xì)胞遺傳學(xué)反應(yīng)。然而,在使用伊馬替尼治療病人的分子研究結(jié)果表明:仍可檢測到BCR-ABL高表達(dá);并且停用伊馬替尼治療后,疾病很容易復(fù)發(fā)。使用伊馬替尼治療后常常存在許多不良反應(yīng),其中比較常見的副作用有腸道反應(yīng)(惡心、嘔吐、腹瀉)、水腫、肌肉痙攣、皮疹。骨髓抑制,肝酶水平升高,特別是在慢性粒細(xì)胞白血病中,骨髓抑制更常見。伊馬替尼作用的時間也很有限,研究還發(fā)現(xiàn)伊馬替尼耐藥可以出現(xiàn)在慢性粒細(xì)胞白血病的任何階段。而伊馬替尼耐藥會導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)和病情惡化。伊馬替尼耐藥有多種機(jī)制,而BCR-ABL依賴型的慢性粒細(xì)胞白血病的耐藥機(jī)制是由于ABL基因位點(diǎn)發(fā)生了突變(其中最主要的是T315I突變),最終使得伊馬替尼不能成功地與ABL激酶位點(diǎn)結(jié)合,最終使得下游的通路異常活化。為了克服這種耐藥,隨后又研究出了第二代酪氨酸激酶抑制劑,最典型的是尼羅替尼、達(dá)沙替尼。與伊馬替尼相比較,尼羅替尼更能有效地抑制野生型BCR-ABL細(xì)胞系和BCR-ABL突變細(xì)胞系的增值。同時,它更能減少白血病負(fù)擔(dān)(二者的有效使用劑量都要比伊馬替尼小),延長患者的生存期,但是對T315I點(diǎn)突變型確無效。但是與伊馬替尼一樣,使用尼羅替尼后會引起副作用:3到4級骨髓抑制,同時會引起膽紅素和脂肪酶升高。達(dá)沙替尼,可以與絲氨酸/蘇氨酸激酶(比如TCL家族激酶、促分裂原活化蛋白激酶、受體酪氨酸激酶)結(jié)合。達(dá)沙替尼能夠有效地對抗伊馬替尼耐藥活性構(gòu)象的問題(因?yàn)樗c酪氨酸家族激酶有更好的親和力)。和尼羅替尼一樣,達(dá)沙替尼可以抑制大部分野生型和BCR-ABL突變細(xì)胞系的增值和激酶活力,但是對T315I位點(diǎn)突變體仍然無效。同時,它也有副作用,尤其是在疾病的急變期,容易引起3-4級骨髓抑制。最近獲得批準(zhǔn)的帕納替尼,已經(jīng)證明了對難治性的慢性粒細(xì)胞白血病患者有療效,帕納替尼是唯一一個能治療伴T315I突變患者的酪氨酸激酶抑制劑。但是它的副作用也很明顯,它與動脈高壓(有時是嚴(yán)重的)和嚴(yán)重的動脈閉塞、靜脈血栓栓塞事件的風(fēng)險增加有關(guān)。酪氨酸的持續(xù)激活導(dǎo)致慢性粒細(xì)胞白血病出現(xiàn)了幾種異常變化:改變細(xì)胞粘連,抑制細(xì)胞凋亡,抑制蛋白酶體降解,有絲分裂原下游通路信號異常激活。所以,如果從BCR-ABL下游通路著手,可能是一個很好的治療方法。泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)對細(xì)胞內(nèi)蛋白的降解有著嚴(yán)格的調(diào)控作用。主要包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo),基因表達(dá),細(xì)胞周期,復(fù)制,分化,免疫反應(yīng),細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)等等。癌細(xì)胞的主要特征是失去了細(xì)胞周期的調(diào)控,癌細(xì)胞失去了DNA修復(fù)功能,同時獲得的基因的高度突變。最后產(chǎn)生大量的、錯誤折疊的蛋白,而這些都是具有細(xì)胞毒性作用的物質(zhì)。為了彌補(bǔ)這個嚴(yán)重的問題,癌細(xì)胞增強(qiáng)了蛋白酶體系統(tǒng)的高表達(dá),從而消除這些蛋白(也就是說癌細(xì)胞的蛋白酶體系統(tǒng)比正常細(xì)胞的UPS更活躍)。與沒有特異性的溶酶體降解相反的是,蛋白酶體對體內(nèi)蛋白的降解具有高度的選擇性,只有那些被小分子泛素標(biāo)記過的蛋白方可被降解。泛素蛋白酶體降解蛋白是一個復(fù)雜的過程,該過程包括泛素,3種酶,蛋白酶體的參與。其中,泛素是一種具有76個賴氨酸殘基的高度保守的蛋白,泛素與底物的賴氨酸結(jié)合成一個異肽鍵,即形成單泛素化底物,隨后,底物可以被更多的泛素標(biāo)記,形成多聚泛素化鏈。泛素分子有7個賴氨酸,但是與底物蛋白結(jié)合的是賴氨酸48號殘基,最終導(dǎo)致靶蛋白的降解。泛素其他的殘基則負(fù)責(zé)蛋白的入核出核、DNA修復(fù)、基因表達(dá)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、胞吞等作用。蛋白降解的第一步便是泛素與泛素活化酶E1鏈的形成,這個過程需要ATP水解供能。然后活化的泛素被轉(zhuǎn)運(yùn)到酶E2(泛素結(jié)合酶),復(fù)雜的E2酶激活泛素并與特定的E3(泛素連接酶)結(jié)合,并將泛素轉(zhuǎn)運(yùn)到相應(yīng)的底物。最后一步,就是蛋白酶體降解的過程。蛋白酶體是一種蛋白水解物,細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有。蛋白酶體由三部分組成,其中主要單元是位于中央的空柱狀多酶核20S。20S由4個環(huán)組成,其中有2個相同的非催化亞基α環(huán),2個催化亞基β環(huán),一起形成了一個αββα結(jié)構(gòu),20S主要負(fù)責(zé)底物的降解。另外2個調(diào)節(jié)單元(19S),二者結(jié)構(gòu)相同,位于20S的2端。19S由2部分組成:外部的是一個蓋子,它負(fù)責(zé)識別被泛素標(biāo)記的多聚泛素化底物,并對泛素進(jìn)行移除。而19S的內(nèi)部(基底部),通過6個ATP亞基的作用,負(fù)責(zé)相關(guān)底物的變性。在最后的降解過程中,白蛋白被19S識別并被19S移去多聚泛素鏈,然后被轉(zhuǎn)入到20S水解中心,目的蛋白最后被其降解為10-12個氨基酸的短肽結(jié)構(gòu)。被FAD批準(zhǔn)的具有選擇特異性的第一線蛋白酶體抑制劑是硼替佐米(PS-341)。它是一個以硼為雙肽的結(jié)構(gòu),能夠可逆地抑制20S上糜蛋白酶的活性,同時還能輕度抑制20S上半胱天冬蛋白酶活性(也就是說硼替佐米是一個20S蛋白酶體抑制劑)。從力學(xué)上來看,酸性物質(zhì)硼替佐米與β亞基內(nèi)部的親核羥基側(cè)鏈形成了共價結(jié)構(gòu)。硼替佐米最初被批準(zhǔn)用于初診的多發(fā)性骨髓瘤,復(fù)發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤,套細(xì)胞淋巴瘤。硼替佐米抗腫瘤的機(jī)制多種多樣,其中包括:抑制NF-κB信號通路、抑制抗凋亡靶基因,抑制幾種抗凋亡蛋白(如Bcl-XL、bcl-2和STAT-3);下調(diào)DNA修復(fù)相關(guān)蛋白的表達(dá),誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER)和促凋亡蛋白反應(yīng)(UPR)。硼替佐米有很好的化療作用,同時還可以克服傳統(tǒng)的耐藥問題,當(dāng)其與其他藥物合用的時候。盡管硼替佐米在血液惡性腫瘤中,取得了很好的治療效果,但是許多病人在疾病好轉(zhuǎn)后又很容易復(fù)發(fā),同時,使用硼替佐米后存在許多細(xì)胞毒性(比如:神經(jīng)毒性),并且還出現(xiàn)了耐藥現(xiàn)象。這些因素就促使了研究這去尋找其他的蛋白酶體抑制劑:能夠克服硼替佐米耐藥、具有更好的性能、更小的細(xì)胞毒性、更廣的抗癌反胃譜。繼而研制出了第二代更好性能的硼替佐米衍生物:卡非佐米(Carfilzomib)�？ǚ亲裘自�2012年被FAD批準(zhǔn)用于復(fù)發(fā)性和難治性多發(fā)性骨髓瘤�？ǚ亲裘着cβ5亞基形成共價結(jié)構(gòu),從而抑制20S上糜蛋白活性。除了卡非佐米,其他的蛋白酶體抑制也正在臨床試驗(yàn)的積極研究之中,比如Marizomib。Marizomib是一種天然乳胞素的衍生物。和硼替佐米及卡非佐米不同的是,Marizomib可以以不可逆的方式與蛋白酶體的三個亞基(β1,β2,和β5)結(jié)合,以更持久、更強(qiáng)的方式抑制糜蛋白酶和胰蛋白酶的活性。值得一提的是,Marizomib可以克服多發(fā)性骨髓瘤及慢性淋巴瘤對硼替佐米的耐藥。與硼替佐米相比,Marizomib的這一臨床特性可能歸功于其對誘導(dǎo)凋亡的Caspase-8有更強(qiáng)的特異性。19S為調(diào)節(jié)顆粒,它的作用是將靶蛋白上的泛素去除,然后將靶蛋白輸送至20S核心顆粒中進(jìn)行降解。如果蛋白的去泛素化過程被阻斷,那么蛋白便不能被降解,因?yàn)?0S核心顆粒上狹窄的通道不允許多聚長鏈的泛素蛋白進(jìn)入催化部位。由此可見,去泛素化酶抑制劑可能會干擾蛋白酶體的活性。去泛素化酶在許多疾病(比如遺產(chǎn)癌癥和神經(jīng)退化病)發(fā)揮很重要的作用,這些酶參與DNA的損失應(yīng)激、DNA的修復(fù)及轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。去泛素化酶根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)可以分為2大類:金屬蛋白酶和半胱蛋白酶。所有的金屬蛋白酶(包括POH1)都含有相同的泛素-蛋白酶結(jié)構(gòu)域JAMM。半胱蛋白酶又分為4類:USP、UCH、OTU、MJD。這兩類酶的分類反應(yīng)了它們對多聚泛素鏈的特異親和性。其中,USP家族(比如USP14)特異性識別泛素自由羥基末端的兩個甘氨酸。因此,USP14只能去除單個的泛素,而不能去除靶蛋白上的整條泛素鏈。另一方面,UCH37(它是UCH家族成員),能特異性識別底物上的二聚泛素。而POH1可以切除從未折疊蛋白酶體底物伸展開來的整條多聚泛素化鏈。深入研究表明,敲出POH1會干擾酶體的組裝,而去除UCH37或者USP14僅僅影響蛋白底物的降解。這表明,在蛋白酶體降解蛋白的過程中,POH1酶對大多數(shù)的去泛素化至關(guān)重要,而UCH37和USP14則扮演更特殊的角色。然而雙重敲除UCH37和USP14后,蛋白酶體的活性也會受到抑制,這也使得它們成為藥物候選的對象。雖然還沒有發(fā)現(xiàn)POH1的抑制劑,但是最卻發(fā)現(xiàn)了UCHL5和USP4的小分子抑制劑:b-AP15。b-AP15最初是在小分子的篩選中被發(fā)現(xiàn)的,它可以誘導(dǎo)溶酶體引起的凋亡,而這一過程并不依賴于腫瘤抑制抑制因子p53。這個化合物可以抑制許多針對Ub-AMC底物的DUB活性,但是它并不影響20S水解蛋白中心的活性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明,b-AP15可以影響腫瘤的進(jìn)展。此外,b-AP15還可以抑制對伊馬替尼耐藥的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增值,同時,它在多種實(shí)體瘤的治療中也有很好的效果。正因?yàn)檫@個小分子抑制劑取得了如此良好的效果,并且其臨床副作用也比較小,所以研究者期待進(jìn)行更深層次的探究,看其是否能夠治療更多種的疾病,當(dāng)然也期待其治療疾病的機(jī)制。為此,我們課題的研究目的:探討b-AP15在慢性粒細(xì)胞白血病伊馬替尼敏感型和伊馬替尼耐藥型細(xì)胞中的作用,為b-AP15在CML中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。結(jié)果1.b-AP15降低Bcr-Abl野生型和Bcr-Abl-T315I突變型細(xì)胞的活力。2.b-AP15誘導(dǎo)Bcr-Abl野生型和Bcr-Abl-T315I突變型細(xì)胞凋亡。3.b-AP15誘導(dǎo)Bcr-Abl野生型和Bcr-Abl-T315I突變型細(xì)胞凋亡與caspase激活及抗凋亡蛋白表達(dá)下調(diào)相關(guān)。4.b-AP15通過抑制19S的去泛素化酶USP14和UCHL5的活性,抑制蛋白酶體功能,隨后細(xì)胞發(fā)生死亡。5.b-AP15誘導(dǎo)的蛋白酶體抑制與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡相關(guān)。6.b-AP15下調(diào)Bcr-Abl蛋白水平的表達(dá),并抑制其下游信號通路。7.b-AP15抑制USP14蛋白水平,使β-catenin水平也下調(diào),進(jìn)而使Bcr-Abl減少,引起CML細(xì)胞死亡。8.b-AP15在慢性粒細(xì)胞白血病病人原發(fā)性單核細(xì)胞中,也能抑制細(xì)胞的活力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。9.b-AP15抑制Bcr-Abl野生型和Bcr-Abl-T315I突變型細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長。結(jié)論1.b-AP15抑制Bcr-Abl野生型和Bcr-Abl-T315I突變型細(xì)胞的活力并誘導(dǎo)其凋亡。我們的研究證實(shí)b-AP15誘導(dǎo)這2類型細(xì)胞死亡是伴隨于b-AP15對蛋白酶體的作用的,同時其誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡也是caspase依賴的,19S蛋白酶體相關(guān)去泛素化酶在凋亡過程中起著關(guān)鍵作用。我們在這里提出了一種通過下調(diào)Bcr-Abl表達(dá)而克服伊馬替尼耐藥的非傳統(tǒng)治療方案,為慢性粒細(xì)胞白血病克服伊馬替尼耐藥的治療提供重大的臨床意義。2.b-AP15通過抑制USP14,使WNT通路中的β-catenin水平下調(diào),進(jìn)而使Bcr-Abl蛋白水平下降,最后引起細(xì)胞死亡。3.b-AP15對Bcr-Abl野生型和Bcr-Abl-T315I突變型兩種類型的裸鼠移植瘤均有抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R733.72
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本文編號：2658983
