本文關(guān)鍵詞：CD133及ALDH在腫瘤侵襲中的作用及機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分：CD133對直結(jié)腸癌侵襲能力的作用研究及機制探討 CD133(prominin-1)是目前文獻中使用率較高的干細胞表面標記分子。CD133在直結(jié)腸癌細胞中廣泛表達,但其分子本身在結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及機制未見報道。因此本研究重點觀察了CD133在結(jié)腸癌體外侵襲中的作用,并深入探討了其導(dǎo)致細胞侵襲能力改變的分子機制。 為篩選適宜的細胞模型,我們用流式細胞術(shù)及Western blotting檢測了CD133在六種結(jié)腸癌中的表達,結(jié)果CD133陽性比例在不同細胞中跨度很大,從1.5%-98%不等。接著我們以惡性程度較高且CD133+率較高(83.52%)的HCT116細胞為模型,分選出CD133high及CD133low細胞進行體外培養(yǎng)及功能研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD133high細胞比CD133iow具有更強的增殖能力(集落形成、MTT檢測)與侵襲能力(transwell檢測),表明高表達干細胞標記CD133的腫瘤細胞在侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮更重要的作用。 為研究CD133分子本身功能,我們用siRNA在體外有效敲低了HCT116田胞中CD133的表達,發(fā)現(xiàn)下調(diào)CD133可明顯降低細胞的侵襲能力,但對癌細胞的增殖能力沒有明顯影響。至于CD133影響結(jié)腸癌腫瘤侵襲能力的分子機制,文獻中未見相關(guān)報道。所以我們檢測了與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的多個信號通路上的重要分子包括Hif-1α、Hif-1β、cdc42、RhoA、Smad7、TIMP-1和TIMP-2,結(jié)果表明敲低CD133僅顯著下調(diào)了TIMP-2的表達。進一步用siRNA在體外有效敲低了TIMP-2的表達,發(fā)現(xiàn)敲低TIMP-2對細胞增殖及侵襲能力的影響與CD133敲低作用一致。首次證明TIMP-2是CD133的下游分子并且CD133通過TIMP-2影響癌細胞的侵襲能力。研究同時發(fā)現(xiàn)CD133及TIMP-2對HCT116細胞侵襲能力的影響與MMP2及MEK/ERK信號通路無關(guān)。 總之,我們的研究首次揭示了干細胞標記CD133分子本身在結(jié)腸癌侵襲過程中發(fā)揮重要作用,并且CD133是通過調(diào)節(jié)TIMP-2而影響癌細胞的侵襲能力。 第二部分ALDH對腫瘤細胞生物學(xué)行為的影響 乙醛脫氫酶(ALDH)是存在于細胞內(nèi)依賴于NAD(P)+的酶,可將醛解毒為相應(yīng)的酸。作為近年來新發(fā)現(xiàn)的腫瘤干細胞標記分子,ALDH已被證實可在多種正常組織及腫瘤組織中作為干細胞的標記分子。ALDH家族在人類細胞中有19個亞型,除ALDH1A1以外其他各亞型在腫瘤中的功能研究還較少,各亞型在不同腫瘤組織中的表達情況也比較復(fù)雜。有研究表明ALDH1A3在乳腺癌及黑色素瘤中有重要作用,而其在結(jié)腸癌及肺癌中的功能卻未見報道。 本研究中我們首先用ALDEFLUOR法檢測了ALDH在六種結(jié)腸癌及兩種肺癌細胞系中的活性,發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌細胞系中的表達情況差異很大,ALDH+細胞比例從7.4-64.5%不等,兩種肺癌細胞系中A549與NCl-H157中ALDH+細胞比例分別為11.9%和1.2%。然后我們以結(jié)腸癌HCT116及肺癌A549田胞作為研究模型,用流式細胞術(shù)分選出了其中ALDHhigh及ALDHlow細胞進行功能研究,發(fā)現(xiàn)ALDHhigh細胞比ALDHlow細胞具有更強的體外增殖能力(MTT、集落形成),并且在HCT116細胞中ALDHhigh細胞比ALDHlow細胞具有更強的體外侵襲能力(transwell檢測),說明ALDHhigh細胞具有干細胞的特性。將分選后的HCT116ALDHhigh細胞及ALDHlow細胞體外再培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間的延長ALDHhigh細胞中ALDH+細胞的比例呈下降趨勢,而ALDHlow細胞中ALDH+細胞的比例呈上升趨勢,并最終趨于HCT116細胞中ALDH+田胞的比例,說明腫瘤干細胞可能是一種功能狀態(tài)(functional status)而不是特殊類型(special entity)。 由于兩種細胞表達不同的ALDH亞型,HCT116主要是ALDH1A3,而A549細胞中同時表達ALDH1A1及ALDH1A3,需要探討不同亞型對腫瘤細胞的影響。為此用siRNA將這兩種亞型的表達進行了有效敲低并進行相關(guān)功能研究。結(jié)果顯示,敲低ALDH1A3后,HCT116和A549細胞的侵襲能力均顯著降低,A549細胞的增殖能力也顯著降低,而HCT116細胞的增殖能力無顯著變化,其機理還在深入研究中。說明ALDH1A3對腫瘤的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力具有重要影響。腫瘤細胞在病人體內(nèi)處于低氧環(huán)境,為此我們利用在培養(yǎng)體系中加入CoCl2的方法來模擬低氧環(huán)境,發(fā)現(xiàn)下調(diào)ALDH1A3后的HCT116細胞在低氧環(huán)境中的凋亡比例增加,表明ALDH1A3與癌細胞的耐低氧能力有關(guān),下調(diào)ALDH1A3降低了HCT116細胞對低氧環(huán)境的耐受。 總之,我們的研究首次揭示了ALDH尤其是其亞型ALDH1A3對結(jié)腸癌及肺癌細胞的生物學(xué)行為具有重要影響,為臨床結(jié)腸癌及肺癌治療提供了新的潛在靶點。 第三部分：小鼠樹突狀細胞肉瘤中SRS19-6MuLV病毒的檢測及致病機理研究 SRS19—6MuLV是小鼠白血病病毒(MuLV)家族成員,分離于我國TSZ系統(tǒng)的白血病,與國外分離的只能引起單一白血病的小鼠白血病病毒不同,該病毒能引起至少4種白血病包括：紅細胞性白血病,髓系白血病,T淋巴瘤及B淋巴瘤。我們實驗室用以前工作中制備的抗小鼠樹突狀肉瘤(DCS)細胞的單克隆抗體983D4篩選DCS的cDNA表達文庫,所獲得的DNA序列經(jīng)測序與小鼠白血病病毒SRS19-6MuLV高度同源。 為探討SRS19-6MuLV是否可引起樹突狀肉瘤細胞,即是否是DCS腫瘤發(fā)生的病毒病因,我們首先用PCR檢測了SRS19-6MuLV基因特異性片段在多種腫瘤細胞及組織中的存在情況,包括DCS細胞、15種小鼠腫瘤細胞、2種小鼠瘤株、12種小鼠正常組織、11種人腫瘤細胞及SRSV/3T3細胞(SRS19-6MuLV轉(zhuǎn)化的陽性對照細胞)。結(jié)果顯示,在DCS細胞、DCS的瘤株LⅡ及SRSV/3T3細胞基因組中存在SRS19-6MuLV特異基因片段,提示DCS細胞基因組中存在SRS19-6MuLV的插入。我們接著用反向PCR法(IPCR,從病毒插入片段設(shè)計引物,向病毒插入位點以外擴增)檢測了SRS19-6MuLV在DCS及SRSV/3T3細胞基因組中的插入位點,找到7個病毒基因的插入位點。通過生物信息學(xué)分析,在插入位點周圍發(fā)現(xiàn)了一些與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的普通脆性位點及Ras相關(guān)的miRNA。提示SRS19-6MuLV是DCS腫瘤發(fā)生的病毒病因。 SRS19-6MuLV不僅能引起四種白血病,我們的結(jié)果還證明SRS19-6MuLV也可以引起小鼠樹突狀細胞肉瘤(DCS),而此病毒并不感染人類細胞,豐富了我們對SRS19-6MuLV致瘤譜及致瘤機理的認識。
【關(guān)鍵詞】：腫瘤 腫瘤干細胞 結(jié)直腸癌 CD133 ALDH 肺癌 DCS SRS19-6MuLV
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R730.23
【目錄】：

• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-13
• 第一部分 CD133對結(jié)直腸癌侵襲能力的作用研究及機制探討13-56
• 引言14-17
• 實驗材料17-22
• 實驗方法22-36
• 1. 細胞培養(yǎng)22
• 2. 細胞總蛋白的提取22
• 3. BCA法檢測蛋白濃度22-23
• 4. Real Time PCR23-26
• 5. Western Blotting26-27
• 6. 細胞CD133~+率分析及CD133~(high)、CD133~(low)分選27-28
• 7. MTT法檢測細胞增殖28
• 8. 細胞集落形成率測定28
• 9. Transwell體外侵襲實驗28-29
• 10. siRNA干擾CD133或TIMP2的表達29-30
• 11. MMP2明膠酶譜檢測30-31
• 12. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴增31
• 13. CD133 shRNA表達載體構(gòu)建31-34
• 14. 慢病毒包裝34
• 15. 慢病毒感染目的細胞及穩(wěn)定細胞株篩選34-35
• 16. 統(tǒng)計學(xué)方法35-36
• 實驗結(jié)果36-50
• 1. CD133在六種結(jié)直腸癌細胞系中的表達36-37
• 1.1 流式細胞術(shù)檢測CD133在六種結(jié)腸癌細胞系中的表達情況36
• 1.2 Western blotting檢測CD133在六種結(jié)腸癌細胞系中的表達情況36-37
• 2. CD133~(high)亞群比CD133~(low)亞群具有更高的體外增殖能力與侵襲能力37-39
• 2.1 流式細胞術(shù)分選CD133~(high)與CD133~(low)細胞并檢測分選純度37
• 2.2 CD133~(high)亞群比CD133~(low)亞群具有更高的體外增殖能力37-38
• 2.3 CD133~(high)亞群比CD133~(low)亞群具有更強的集落形成能力38
• 2.4 CD133~(high)比CD133~(low)亞群具有更強的體外侵襲能力38-39
• 3. siRNA下調(diào)CD133后降低了HCT116細胞的侵襲能力39-41
• 3.1 siRNA可有效下調(diào)HCT116細胞中CD133的表達39-40
• 3.2 siRNA下調(diào)CD133后對HCT116細胞增殖能力沒有影響40-41
• 3.3 siRNA下調(diào)CD133后降低了HCT116細胞的體外侵襲能力41
• 4. CD133的下調(diào)影響TIMP-2的表達41-44
• 4.1 侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路分子篩查41-42
• 4.2 敲低CD133可使TIMP-2表達明顯降低42-43
• 4.3 TIMP-2在CD133~(high)及CD133~(low)HCT116細胞中的表達沒有區(qū)別43
• 4.4 敲低CD133對MMP及TIMP家族其他成員的影響43-44
• 5. siRNA下調(diào)TIMP-2后對CD133表達無影響且可以降低細胞的體外侵襲能力44-47
• 5.1 siRNA可以有效下調(diào)TIMP-2的表達44-45
• 5.2 siRNA下調(diào)TIMP-2后對CD133表達沒有影響45-46
• 5.3 siRNA下調(diào)TIMP-2后對細胞的體外增殖能力沒有影響46
• 5.4 siRNA下調(diào)TIMP-2后可降低細胞的體外侵襲能力46-47
• 6. MMP2及MEK/ERK通路不參與CD133及TIMP-2對細胞的影響47-48
• 7. CD133 shRNA表達載體的構(gòu)建及CD133穩(wěn)定敲低細胞系的建立48-50
• 討論50-55
• 小結(jié)55-56
• 第二部分：ALDH對腫瘤細胞生物學(xué)特性的作用研究56-90
• 引言57-59
• 實驗材料59-63
• 實驗方法63-72
• 1. 細胞培養(yǎng)63
• 2. 細胞總蛋白的提取63
• 3. BCA法檢測蛋白濃度63-64
• 4. Real Time PCR64-66
• 5. Western Blotting66-67
• 6. 細胞ALDH~+率分析及ALDH~(high)、ALDH~(low)分選67-68
• 7. MTT法及CCK8檢測細胞增殖68-69
• 8. 細胞集落形成率測定69
• 9. Transwell體外侵襲實驗69-70
• 10. siRNA干擾ALDH1A1或ALDH1A3的表達70
• 11. 細胞免疫化學(xué)染色70-71
• 12. 流式檢測細胞周期71
• 13. 細胞凋亡檢測71
• 14. 統(tǒng)計學(xué)方法71-72
• 實驗結(jié)果72-85
• 1. 流式檢測ALDH在幾種結(jié)腸癌及肺癌細胞系中的表達72-73
• 2. ALDH~(high)與ALDH~(low)細胞的生物學(xué)特點73-76
• 2.1 HCT116/A549細胞中ALDH~(high)與ALDH~(low)細胞的分選73
• 2.2 HCT116/A549細胞中ALDH~(high)與ALDH~(low)細胞的體外生長的差別73-74
• 2.3 HCT116細胞中ALDH~(high)與ALDH~(low)細胞的集落形成能力差別74
• 2.4 HCT116細胞中ALDH~(high)與ALDH~(low)細胞周期的差別74-75
• 2.5 HCT116細胞中ALDH~(high)與ALDH~(low)細胞再培養(yǎng)75
• 2.6 HCT116細胞中ALDH~(high)與ALDH~(low)細胞的體外侵襲能力的觀察75-76
• 3. ALDH1A1及ALDH1A3在幾種結(jié)腸癌細胞中的表達情況76-78
• 3.1 Western boltting檢測ALDH1A1及ALDH1A3在幾種結(jié)腸癌及肺癌細胞系中的表達情況76-77
• 3.2 間接免疫熒光檢測ALDH1A1及ALDH1A3在HCT116/A549細胞中的表達情況77-78
• 4. siRNA下調(diào)ALDH1A1及ALDH1A3對HCT116/A549細胞的影響78-85
• 4.1 siRNA可有效下調(diào)ALDH1A1及ALDH1A3的表達78
• 4.2 siRNA下調(diào)ALDH1A3或ALDH1A1后對HCT116/A549中ALDH~+細胞比例的影響78-79
• 4.3 siRNA下調(diào)ALDH1A1及ALDH1A3后對HCT116/A549細胞凋亡沒有影響79-80
• 4.4 siRNA下調(diào)ALDH1A3后對HCT116增殖能力沒有影響80-81
• 4.5 siRNA下調(diào)ALDH1A1及ALDH1A3后對A549的增殖能力有不同影響81
• 4.6 siRNA下調(diào)ALDH1A3后對A549細胞周期的影響81
• 4.7 siRNA下調(diào)ALDH1A3后能降低HCT116的體外侵襲能力81-82
• 4.8 siRNA下調(diào)ALDH1A3后能降低A549的體外侵襲能力82-83
• 4.9 siRNA下調(diào)ALDH1A3后能降低HCT116細胞對CoCL_2模擬的低氧環(huán)境的耐受83-85
• 討論85-89
• 小結(jié)89-90
• 第三部分：小鼠樹突狀細胞肉瘤中SRS19-6MULV病毒的檢測及致病機理研究90-106
• 引言91-92
• 實驗材料92-94
• 實驗方法94-98
• 1. 細胞培養(yǎng)94
• 2. 培養(yǎng)細胞及組織基因組DNA提取94-95
• 3. PCR擴增目的片段95
• 4. PCR產(chǎn)物膠回收95-96
• 5. 透射電鏡檢測DCS及SRSV/3T3細胞中有無病毒顆粒96
• 6. IPCR方法檢測SRS19-6MuLV病毒在DCS及SRSV/3T3基因組中的插入位點96-97
• 7. 序列及插入位點生物信息學(xué)分析97-98
• 實驗結(jié)果98-103
• 1. DCS及其他小鼠腫瘤細胞中SRS19-6MuLV病毒的檢測結(jié)果98
• 2. 小鼠正常組織、細胞中SRS19-6MuLV病毒的檢測結(jié)果98-99
• 3. 小鼠瘤株及SRSV/3T3細胞中SRS19-6MuLV病毒的檢測結(jié)果99-100
• 4. 人腫瘤細胞中SRS19-6MuLV病毒的檢測結(jié)果100
• 5. 透射電鏡檢測病毒顆粒100-101
• 6. SRS19-6MuLV病毒在DCS細胞及SRSV/3T3細胞中插入位點101
• 7. 序列及插入位點生物信息學(xué)分析101-103
• 討論103-105
• 小結(jié)105-106
• 參考文獻106-114
• 縮略語114-116
• 文獻綜述116-132
• 參考文獻126-132
• 附錄：已發(fā)表文章132-134
• 致謝134-135
• 個人簡歷135-136

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 李存璽,顧蓓,高進;小鼠樹突狀細胞肉瘤細胞系的建立及形態(tài)學(xué)鑒定[J];解剖學(xué)報;1997年01期

2 段德義,劉玉琴,高進,顧蓓,趙雪梅;DCS細胞中SRS19-6白血病病毒3’-cDNA序列的克隆[J];中國免疫學(xué)雜志;2001年01期

  本文關(guān)鍵詞：CD133及ALDH在腫瘤侵襲中的作用及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：265635