本文關(guān)鍵詞：表觀遺傳學修飾在婦科腫瘤診斷中的應用價值研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：表觀遺傳學修飾(Epigenetics)是指在不改變DNA序列的前提下,細胞內(nèi)其他可遺傳物質(zhì)發(fā)生改變而引起的基因表達或細胞表型變化,這種改變在胚胎發(fā)育和細胞增殖過程中能穩(wěn)定遺傳且具有可逆潛能。表觀遺傳學修飾主要包括兩大類,一類是基因選擇性轉(zhuǎn)錄表達的調(diào)控,主要包括DNA甲基化、染色質(zhì)重塑、組蛋白修飾、基因組印記、基因沉默、核仁顯性及休眠轉(zhuǎn)座子激活等,另一類為基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控,主要包括基因組中非編碼RNA.MicroRNA.反義RNA.內(nèi)含子及核糖開關(guān)等。與經(jīng)典遺傳學以研究基因序列影響生物學功能為核心相比,表觀遺傳學主要研究這些“表觀遺傳現(xiàn)象”建立和維持的機制,作為經(jīng)典遺傳學的補充,表觀遺傳學讓我們更全面的理解基因調(diào)節(jié)的機制。近年來研究已證實表觀遺傳學修飾在干細胞分化,早期胚胎發(fā)育及多種疾病(腫瘤、自身免疫疾病及代謝性疾病等)的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用；特別是在腫瘤研究領(lǐng)域,表觀遺傳學修飾與原癌基因激活、抑癌基因失活、DNA損傷修復缺陷及腫瘤干細胞分化等密切相關(guān)。 針對腫瘤表觀遺傳學機制研究的最終目的是為了應用于臨床診斷及預防治療。DNA甲基化和MicroRNA在診斷方面的研究已經(jīng)趨于成熟,Fujiwara等研究表明5個基因血清游離DNA甲基化譜在診斷早期肺癌方面特異性和陽性預測值分別為85%和75%,同樣眾多研究表明MicroRNA表達譜可應用于乳腺癌的病理分型(如雌孕激素受體狀態(tài)、腫瘤分期、腫瘤轉(zhuǎn)移及Her2狀態(tài)等)。本研究主要研究DNA甲基化及MicrORNA表達譜在早期上皮性卵巢癌及子宮平滑肌腫瘤診斷分類中的應用。 第一部分：多重巢式甲基化特異性PCR在早期上皮性卵巢癌診斷中的應用研究 背景和目的 卵巢癌發(fā)病率位居女性惡性生殖系統(tǒng)腫瘤第三位,病死率居第一位,占所有因癌癥死亡女性患者的3%,其中90%以上為上皮性卵巢癌。卵巢癌發(fā)病隱匿,臨床確診時約85%患者疾病己為晚期(FIGOⅡ-Ⅳ期),5年生存率僅為30-44%,而早期卵巢癌(FIGOⅠ期)患者5年生存率高達93%。因此,除積極尋找新的有效的治療方式外,探討卵巢癌發(fā)生發(fā)展的生物學機制,研發(fā)新型卵巢癌早期診斷技術(shù)迫在眉睫。 目前尚無簡便有效的、可常規(guī)應用的卵巢癌早期診斷方法。CA125是目前普遍使用的卵巢癌標志物,但僅有50%的Ⅰ期卵巢癌患者CA125水平升高,且其他疾病(如子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢纖維瘤、盆腔炎性疾病及某些其他惡性腫瘤等)亦可引起CA125水平升高,故其敏感性和特異性較差,卵巢癌陽性預測值僅有100%～35%。總體而言,對于血清CA125檢測、經(jīng)陰道超聲探查等傳統(tǒng)的診斷方法單一或聯(lián)合應用,目前均無證據(jù)顯示可降低人群的卵巢癌發(fā)病率和(或)病死率,其主要原因在于這些方法的假陰性或假陽性率均過高,敏感性和特異性達不到臨床需要。 DNA甲基化,即在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的第5位碳原子上生成5-甲基胞嘧啶,是重要的表觀遺傳學機制。DNA啟動子區(qū)異常高甲基化是抑癌基因失活的重要機制,在某些情況下可能是唯一的機制,在癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。作為癌癥發(fā)生的早期事件,DNA異常甲基化檢測可以在患者出現(xiàn)臨床表現(xiàn)或者影像學證據(jù)之前做到分子診斷,為癌癥早期診斷提供新的途徑�，F(xiàn)己證實腫瘤患者中血清游離DNA含量明顯升高,其來源主要有2種機制：1、增殖旺盛的腫瘤細胞持續(xù)釋放DNA進入血液循環(huán)；2、腫瘤細胞的壞死、凋亡或直接入血裂解使血清游離DNA含量增高。血清游離DNA具有與原發(fā)腫瘤組織相一致的分子遺傳學改變(如啟動子區(qū)高甲基化、基因突變、微衛(wèi)星不穩(wěn)定和雜合性缺失等),可間接反映腫瘤的發(fā)生發(fā)展情況。使用血清游離DNA甲基化檢測在其他癌癥如肺癌、頭頸部腫瘤、前列腺癌等己被證實可行,因此卵巢癌患者血清游離DNA甲基化檢測,是一種可行的具有臨床實用價值的卵巢癌早期診斷技術(shù)。針對血清游離DNA微量,甲基化特異性PCR敏感性不足的特點,課題組將多重PCR、巢式PCR與甲基化特異性PCR相結(jié)合,開發(fā)出全新的多重巢式甲基化特異性PCR (Multiplex-MSP)檢測方法,已滿足血清微量腫瘤游離DNA樣本多基因甲基化檢測需要。 材料和方法 1.上皮性卵巢癌特異性甲基化基因的篩選。 2.臨床卵巢腫瘤及正常對照病人血清及組織樣本的收集。 3.引物的設計合成及多重巢式甲基化特異性PCR反應體系的優(yōu)化。 4.多重巢式甲基化特異性PCR檢測血清及組織樣本甲基化水平。 5.卵巢癌血清與組織甲基化譜對照研究。 6.回顧性分析評估多重巢式甲基化特異性PCR檢測在上皮性卵巢癌早期診斷中的意義。 7.雙盲實驗進一步驗證多重巢式甲基化特異性PCR檢測在上皮性卵巢癌早期診斷中的作用。 結(jié)果 1.通過Pubmed檢索篩選出7個與卵巢癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的高頻甲基化基因APC, RASSF1A, CDH1, RUNX3, TFP12, SFRP5和OPCML。 2.將多重PCR、巢式PCR與甲基化特異性PCR相結(jié)合,開發(fā)出全新的多重巢式甲基化特異性PCR檢測方法。 3.應用多重巢式甲基化特異性PCR對20例卵巢癌血清及配對組織進行檢測,證實血清游離DNA甲基化譜完全包含于腫瘤組織DNA甲基化譜。 4.應用多重巢式甲基化特異性PCR回顧140例卵巢腫瘤及正常女性血清標本,結(jié)果證實該方法的特異性為90.57%,敏感性為89.66%；特別是在 背景和目的 臨床上,常見的子宮平滑肌腫瘤主要包括良性子宮平滑肌瘤和惡性子宮平滑肌肉瘤,它們的分類主要基于以下三個標準：細胞異型性、有絲分裂相、腫瘤細胞壞死,典型的子宮平滑肌瘤形態(tài)學上主要表現(xiàn)為無細胞異型性,小于10MF/10HPF的有絲分裂相,可能會表現(xiàn)出玻璃樣壞死(如缺血性),但缺乏典型的凝固性腫瘤細胞壞死；相反,惡性子宮平滑肌肉瘤至少具備以下3個特征中的2個,明顯的細胞異型性,大于10MF/10HPF的有絲分裂相及典型的凝固性腫瘤細胞壞死。 在典型的子宮平滑肌瘤和子宮平滑肌肉瘤之間,存在幾大類中間類型的子宮平滑肌腫瘤,它們表現(xiàn)一些但不是所有的惡性腫瘤的特征,主要包括以下幾大類：不典型性、惡性潛能未定型、有絲分裂活躍型、富于細胞性等,它們的診斷標準主要依據(jù)1994年發(fā)表的Bell準則及2003年WHO腫瘤分類標準。除典型的良性子宮平滑肌瘤外,其他類型的子宮平滑肌腫瘤發(fā)病率很低,診斷也存在一定的分歧,對它們的研究大部分集中于臨床及病理階段,其分子生物學研究較少。 傳統(tǒng)觀點認為,1、子宮平滑肌肉瘤為突然發(fā)生(de novo),沒有癌前病變；2、不典型性子宮平滑肌瘤是普通子宮平滑肌瘤的一個變種,屬于良性病變。但隨著目前對各類型子宮平滑肌腫瘤的分子生物學研究進展,這兩個觀點受到了挑戰(zhàn)。臨床上對不典型性子宮平滑肌瘤沒有明確的診療指南,但根據(jù)文獻報道,這類腫瘤雖然具有高治愈率和低復發(fā)率的特點,但也有病例(3/18)死于這類疾病,但與子宮肉瘤相比有更長的潛伏期(6年vs2.1年),在臨床實踐中,我們也看到極個別的不典型性子宮平滑肌瘤在短時間內(nèi)進展成為子宮肉瘤的情況；另外不典型性子宮平滑肌瘤部分存在染色體1p缺失,與典型的子宮肌瘤相比與平滑肌肉瘤更為相似。在前期研究中,課題組對167例不同類型的子宮平滑肌腫瘤從組織形態(tài)學、基因突變、染色體變異及免疫組化角度進行了整體分析。研究顯示,MED12基因突變在不典型性子宮平滑肌瘤與子宮平滑肌肉瘤中的突變率均低于15%(P0.05),普通子宮平滑肌瘤突變率為75%；P53基因突變在不典型性子宮平滑肌瘤與子宮平滑肌肉瘤中的突變率分別為12%和24%(P0.05),而普通子宮平滑肌瘤未發(fā)現(xiàn)突變；PTEN缺失在不典型性子宮平滑肌瘤與子宮平滑肌肉瘤中也具有相似的缺失頻率(P0.05)。課題組進一步挑選與子宮平滑肌肉瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵蛋白,進行免疫組化染色,聚類分析顯示不典型性子宮平滑肌瘤與子宮平滑肌肉瘤具有相似的蛋白表達譜。基于以上研究基礎,課題組假設不典型性子宮肌瘤可能代表有能力演變?yōu)樽訉m平滑肌肉瘤的中間形式,可能是其癌前病變。 本研究著重從MicroRAN表達譜、DNA甲基化角度對子宮平滑肌腫瘤進行研究,以尋求不典型性子宮肌瘤可能是子宮平滑肌肉瘤的癌前病變這一假說的更多證據(jù)。 材料和方法 1.收集美國Northwestern University, Northwestern memorial hospital及山東大學齊魯醫(yī)院1993～2013年185例不同類型的子宮平滑肌腫瘤(包括38例子宮平滑肌肉瘤、42例不典型性子宮平滑肌瘤、18例惡性潛能未定的子宮平滑肌瘤、22例富于細胞性子宮平滑肌瘤、7例有絲分裂活躍型子宮平滑肌瘤及58例普通子宮平滑肌瘤),所有病例均有完整的臨床、病理及隨訪資料。 2.提取組織形態(tài)學最典型的子宮平滑肌肉瘤,不典型性子宮平滑肌瘤,惡性潛能未定的子宮平滑肌瘤,富于細胞性子宮平滑肌瘤,普通子宮平滑肌瘤及正常子宮肌層各8例RNA,利用FirePlexTM平臺行miRNA表達譜分析。 3.提取18例普通子宮平滑肌瘤及配對子宮肌層新鮮組織DNA,利用Infinium Human Methylation27K BeadChip行全基因組甲基化譜分析。 4.提取30例子宮平滑肌肉瘤,25例不典型性子宮平滑肌瘤,12例普通子宮平滑肌瘤及6例正常子宮肌層DNA,利用Sequenom MassArray甲基化檢測平臺對候選基因(KLF11、DLEC1及RUNX3)進行啟動子CpG島甲基化分析。 結(jié)果 1.非監(jiān)督聚類分析及馬氏距離分析均顯示不典型性子宮平滑肌瘤與子宮平滑肌肉瘤有相似的MicroRAN表達譜。 2. Infinium Human Methylation27K BeadChip篩選出子宮平滑肌瘤相對正常子宮肌層顯著高甲基化的基因KLF11及DLEC1(P0.001). 3.不典型性子宮平滑肌瘤中KLF11、DLEC1及RUNX3甲基化譜與子宮平滑肌肉瘤相近(P0.05),而與子宮平滑肌瘤差異顯著(P0.05)。 4.結(jié)合課題組前期研究結(jié)果,對全部類型的子宮平滑肌腫瘤進行主成成分3D距離分析,發(fā)現(xiàn)不典型性子宮平滑肌瘤與子宮平滑肌肉瘤距離最為接近。 結(jié)論 1.相對于普通子宮平滑肌瘤,不典型性子宮平滑肌瘤與子宮平滑肌肉瘤有相似的MicroRAN表達譜及甲基化譜,從表觀遺傳學角度提示不典型子宮平滑肌瘤可能為子宮平滑肌肉瘤的癌前病變。 2.臨床上,不典型性平滑肌瘤的處理原則應不同于普通子宮平滑肌瘤,須嚴密隨訪。
【關(guān)鍵詞】：上皮性卵巢癌 Multiplex-MSP 血清游離DNA 早期診斷 41例早期卵巢癌(Ⅰ期)檢測方面 特異性為90.57% 敏感性為85.37% 明顯優(yōu)于傳統(tǒng)CA125檢測(P<0.05)。5.雙盲實驗進一步證實多重巢式甲基化特異性PCR檢測早期上皮性卵巢癌的靈敏性為83.33% 特異性為82.76%。結(jié)論1.血清游離DNA甲基化可以準確反映腫瘤組織DNA甲基化狀態(tài) 可以作為腫瘤早期診斷的標記物。2.本研究所開發(fā)的血清游離DNA多重巢式甲基化特異性PCR是高效準確檢測血清游離DNA甲基化狀態(tài)的新方法。3.多重巢式甲基化特異性PCR檢測方法有望應用于上皮性卵巢癌的早期診斷。 子宮平滑肌肉瘤 不典型性平滑肌瘤 MicroRAN表達譜 DNA甲基化
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.3
【目錄】：

• 中文摘要6-13
• 主要創(chuàng)新點13-14
• ABSTRACT14-23
• THE CREATATIVE POINTS IN THIS STUDY23-24
• 符號說明24-26
• 前言26-28
• 第一部分 多重巢式甲基化特異性PCR在早期上皮性卵巢癌診斷中的應用研究28-48
• 材料與方法32-42
• 結(jié)果42
• 討論42-45
• 結(jié)論45-46
• 主要創(chuàng)新點46
• 主要不足46-48
• 第二部分 MicroRNA表達譜及DNA甲基化在子宮平滑肌腫瘤診斷分類中的應用研究48-68
• 材料與方法52-61
• 結(jié)果61-62
• 討論62-66
• 結(jié)論66-67
• 主要創(chuàng)新點67
• 主要不足67-68
• 附圖68-82
• 附表82-100
• 參考文獻100-114
• 致謝114-116
• 攻讀學位期間取得的學術(shù)成果目錄116-118
• 外文論文118-147
• 學位論文評閱及答辯情況表147

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 申彥;張新瑩;師宜荃;王穎;郭東輝;;Glut-1、HIF-1α及P53在卵巢癌中的表達及意義[J];天津醫(yī)科大學學報;2013年05期

2 李雅瓊;王偉;黃燕芳;廖之君;楊曉煜;;印記基因DLK1的研究進展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2014年09期

3 楊立;張穎;趙倩;程一姍;王冰冰;袁曉瑞;;輸卵管結(jié)扎對卵巢癌影響的研究[J];現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展;2013年12期

4 劉麗雅;洪振豐;;表觀遺傳學與非酒精性脂肪肝病的研究進展[J];醫(yī)學綜述;2014年04期

5 李曉森;宗珊;劉曉霞;岳瑛;姬春梅;;彩色超聲鑒別卵巢惡性腫瘤的危險因素分析[J];中國婦幼保健;2014年04期

6 馬丁;;上皮性卵巢癌組織起源與腫瘤發(fā)生新進展——“二元論”學說[J];中國實用婦科與產(chǎn)科雜志;2014年01期

7 薛開先;;表遺傳學幾個重要問題的述評[J];遺傳;2014年03期

8 李麗軍;貝朝勇;;超聲、糖類抗原125、人附睪蛋白4對上皮性卵巢癌診斷及監(jiān)測價值[J];臨床醫(yī)學工程;2014年04期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 張宏亮;5-雜氮-2’-脫氧胞苷干預在腹腔注射香煙提取物所致小鼠肺氣腫模型中的作用及機制[D];中南大學;2013年

2 趙蓉蓉;酒依賴患者全基因組DNA甲基化模式研究[D];中南大學;2013年

3 李衛(wèi);錳超氧化物歧化酶模擬化合物對人上皮性卵巢癌細胞SKOV3抑制作用的體內(nèi)外研究[D];南方醫(yī)科大學;2013年

4 陳小祥;hOGG1基因變異與女性常見惡性腫瘤乳腺癌、卵巢癌易感性及其分子機制研究[D];南京大學;2011年

5 馮沖;RNA m~6A去甲基化酶Alkbh5的結(jié)構(gòu)與功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2014年

6 程磊;體細胞克隆技術(shù)的若干改進及其在轉(zhuǎn)基因克隆牛中的應用[D];內(nèi)蒙古大學;2013年

7 劉玲;miRNA-mRNA差異表達與卵巢癌多藥耐藥關(guān)系的研究[D];廣西醫(yī)科大學;2014年

8 徐小飛;MicroRNA-182對漿液性卵巢癌生物學行為的影響及其分子機制研究[D];山東大學;2014年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 程一姍;輸卵管結(jié)扎對卵巢癌影響的臨床分析[D];鄭州大學;2013年

2 楊曉倩;LKB1及mTOR在卵巢上皮性腫瘤中的表達及意義[D];河北醫(yī)科大學;2013年

3 陳昌賢;卵巢上皮癌多藥耐藥分子機制生物信息學研究[D];廣西醫(yī)科大學;2013年

4 高思國;龍葵皂苷分離純化、體外抗腫瘤活性及其分子機制研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2011年

5 金志新;HUNK啟動子區(qū)CpG島甲基化在結(jié)直腸癌中的檢測及其臨床意義[D];福建醫(yī)科大學;2013年

6 石大友;卵巢癌患者呼氣中揮發(fā)性標志物的篩查與定量分析[D];安徽醫(yī)科大學;2013年

7 丁玉霞;雌性牙鲆性激素合成酶相關(guān)基因SNP和DNA甲基化與繁殖內(nèi)分泌相關(guān)性研究[D];中國海洋大學;2013年

8 張曉梅;共軛亞油酸誘導的初生小鼠下丘腦POMC啟動子甲基化的研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學;2013年

9 楊頁多;HNF-1β與鐵在子宮內(nèi)膜異位癥與卵巢癌發(fā)生關(guān)系中的作用[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2011年

10 陳芳;葉酸、SAM對DNMT1、MeCP2的影響及在宮頸癌變中的作用[D];山西醫(yī)科大學;2013年

  本文關(guān)鍵詞：表觀遺傳學修飾在婦科腫瘤診斷中的應用價值研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：264413