【摘要】：前言:我國胃癌死亡率排名第二,是僅排在肺癌之后的惡性腫瘤。盡管在過去的幾十年里發(fā)展中國家的胃癌發(fā)病率有所下降,但其依舊是發(fā)展中國家十分重要的健康威脅。盡管外科手術以及輔助治療的手段在不斷進步,但與其他惡性腫瘤相比,胃癌預后總體情況仍然表現(xiàn)不佳。由于早期胃癌臨床癥狀并不明顯,許多胃癌患者在確診時已處于腫瘤中晚期階段,而此時胃癌多具有高侵襲性、高轉移性和高死亡率的特點,胃癌患者5年生存率僅為20%-30%。因此,尋找能夠影響胃癌進展的分子信號通路,明確胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制,對胃癌的早期診斷和研發(fā)中晚期胃癌的治療藥物具有十分重要的作用。TBX2屬于T-box gene(TBX)家族成員,從低等無脊椎動物到人類等許多物種中廣泛存在。所有TBX轉錄因子都有一個保守的T-box結構域,該結構域與特定的DNA序列結合,能夠發(fā)揮轉錄刺激或轉錄抑制因子的作用。TBX2定位于人的17q23染色體,在上下肢,乳腺,肺臟,心臟,眼以及腎臟等組織器官的發(fā)育中具有重要作用。TBX2蛋白作為轉錄因子,可以調(diào)控細胞周期進展、促進細胞增殖、遷移、抑制細胞凋亡,能夠在細胞分化前促進前體細胞的增生和生存。近期的研究表明TBX2是可以促進腫瘤進展的癌基因,TBX2首先被發(fā)現(xiàn)在人乳腺癌細胞中存在過表達,并且與乳腺癌的不良預后密切相關。隨后大量研究表明TBX2過表達在多種人類腫瘤中普遍存在。TBX2能夠促進腫瘤細胞增殖,TBX2通過直接調(diào)節(jié)細胞周期蛋白Cdkn2a(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A)和p21等表達起到促進腫瘤細胞增殖的作用。另外,TBX2還與DNA損傷密切相關,在BRCA1和BRCA2相關的乳腺癌中TBX2呈現(xiàn)擴增,并且與DNA損傷應答相關。TBX2可以促進腫瘤的侵襲和轉移,在鼠乳腺癌模型中TBX2促進細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉化(EMT)并促進腫瘤細胞發(fā)生侵襲和轉移。然而,TBX2在胃癌中的臨床意義及生物學功能仍不清楚。本實驗旨在研究TBX2蛋白在胃癌組織及正常胃組織的表達情況,分析其與臨床病理因素之間的相關性。檢測TBX2在胃癌細胞中的表達含量,分析其對胃癌細胞增殖和侵襲能力的影響。同時探討TBX2在胃癌中發(fā)揮生物學作用時所依賴的分子機制。目的:分析胃癌組織中TBX2的表達量與臨床病理因素之間的關系。通過實驗探討TBX2對胃癌細胞生物學行為的影響,證明TBX2是胃癌中重要的致癌基因,為診斷和治療胃癌提供新的靶點。方法:從2008-2010年在中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院實施手術并且術前未行任何放化療的患者中選取161例原發(fā)性胃癌樣本和10例正常胃組織。組織經(jīng)10%中性福爾馬林液固定、石蠟包埋。通過免疫組織化學實驗分析胃癌組織中TBX2的表達量與臨床病理因素之間的關系。從ATCC和中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫購買胃癌細胞系BGC-823、SGC-7901、AGS、GES1、MKN-1。通過細胞轉染實驗技術,實時熒光定量PCR和免疫蛋白印跡雜交實驗觀察TBX2在胃癌細胞中的表達情況。通過細胞集落生成實驗和MTT檢測轉染TBX2后胃癌細胞增殖情況。通過基質(zhì)膠實驗觀察轉染TBX2后胃癌細胞侵襲情況。結果:TBX2在胃癌組織中過表達:采用免疫組化方法檢測TBX2蛋白在161例胃癌標本及10例正常胃組織中的表達情況發(fā)現(xiàn)TBX2蛋白在細胞核和細胞漿中均存在染色。在161例胃癌組織中,55.9%(90/161例)呈TBX2高表達;而在正常胃組織中,僅呈TBX2陰性表達。TBX2蛋白表達與胃癌臨床病理因素相關性:進一步分析TBX2表達與臨床病理因素的相關性,包括患者年齡,性別,組織分化程度,TNM分期等。我們發(fā)現(xiàn)TBX2的過表達與較高的TNM分期(p0.0001),腫瘤浸潤深度(T期)(p=0.0460)和淋巴結轉移(p=0.0051)顯著相關。但是卻沒有發(fā)現(xiàn)TBX2與其他因素存在顯著相關性。單因素回歸分析顯示TBX2表達、臨床分期和復發(fā)能顯著影響患者預后。Cox多因素回歸顯示分期和復發(fā)能獨立預測患者不良預后。生存曲線和Log-rank檢驗顯示TBX2與患者不良預后顯著相關。TBX2促進胃癌細胞的增殖和侵襲:通過western blot技術檢測胃癌細胞系中TBX2的內(nèi)源表達量發(fā)現(xiàn)BGC-823細胞系內(nèi)源表達量較高,而SGC-7901細胞系內(nèi)源表達量較低。通過TBX2質(zhì)粒轉染以及siRNA干擾對這兩個細胞系分別進行處理,結果顯示TBX2質(zhì)粒轉染后能夠顯著上調(diào)TBX2的mRNA以及相應蛋白表達量,而siRNA干擾則能夠明顯下調(diào)TBX2的mRNA及蛋白表達量。通過MTT實驗,我們發(fā)現(xiàn)TBX2轉染后能夠增強SGC-7901胃癌細胞系的增殖能力,而TBX2特異性siRNA干擾能夠明顯抑制BGC-823細胞的增殖能力。為了探究TBX2對于細胞侵襲所發(fā)揮的作用,進行transwell實驗,實驗結果表明TBX2質(zhì)粒轉染后細胞的侵襲能力顯著增強,而TBX2干擾后細胞的侵襲能力降低(p0.05)。TBX2調(diào)控侵襲相關蛋白:通過體外細胞實驗上調(diào)和抑制了TBX2的表達,然后篩查與細胞增殖和侵襲密切相關的蛋白的表達變化情況。實驗結果顯示與對照組細胞相比,TBX2過表達能夠顯著上調(diào)MMP2和MMP9蛋白的表達量,而TBX2干擾則抑制了這些蛋白的表達。結果說明TBX2可能通過MMP2或MMP9蛋白來調(diào)控胃癌細胞的增殖和侵襲。TBX2調(diào)控上皮間質(zhì)轉化:檢測與上皮間質(zhì)轉化有關因子的表達量,結果顯示TBX2過表達能夠下調(diào)SGC-7901細胞系中E-cadherin的含量水平,而TBX2干擾會稍許上調(diào)E-cadherin的表達量。能夠進一步證實在胃癌細胞系中,TBX2能夠通過ERK-MMP-2信號通路促進細胞惡性表型的發(fā)生,同時可以加快細胞上皮間質(zhì)轉化這一進程。TBX2調(diào)控ERK信號通路:我們研究了MAPK信號通路:JNK,p38以及ERK,這些信號通路都是調(diào)控MMP-2表達的信號通路。我們發(fā)現(xiàn)TBX2過表達能夠顯著上調(diào)ERK的磷酸化水平,表明TBX2上調(diào)MMP-2的表達很有可能是通過誘導ERK信號通路的活化而進行的。TBX2調(diào)控細胞周期相關蛋白:通過研究細胞周期相關蛋白的變化情況。我們發(fā)現(xiàn)TBX2過表達能夠明顯上調(diào)cyclin E的表達水平,而敲除TBX表達則下調(diào)cyclin E的表達。另外TBX2轉染抑制了p21的表達,而敲除TBX2表達會上調(diào)p21的表達,表明TBX2上調(diào)細胞增殖很有可能是通過對p21的抑制和對cyclin E的上調(diào)來實現(xiàn)的。結論:在胃癌進展過程,TBX2可以在人類胃癌組織中過量表達。TBX2過表達促進胃癌細胞的生長和侵襲。TBX2通過ERK-MMP和EMT介導胃癌細胞侵襲轉移。還可以通過下調(diào)p21蛋白表達和上調(diào)cyclin E蛋白表達介導細胞增殖。
【圖文】：

胃癌組織中TBX2蛋白質(zhì)的表達（放大倍數(shù),400X）

TBX2在胃癌細胞系中的表達
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2

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本文編號：2655682