【摘要】：前言:我國胃癌死亡率排名第二,是僅排在肺癌之后的惡性腫瘤。盡管在過去的幾十年里發(fā)展中國家的胃癌發(fā)病率有所下降,但其依舊是發(fā)展中國家十分重要的健康威脅。盡管外科手術(shù)以及輔助治療的手段在不斷進(jìn)步,但與其他惡性腫瘤相比,胃癌預(yù)后總體情況仍然表現(xiàn)不佳。由于早期胃癌臨床癥狀并不明顯,許多胃癌患者在確診時(shí)已處于腫瘤中晚期階段,而此時(shí)胃癌多具有高侵襲性、高轉(zhuǎn)移性和高死亡率的特點(diǎn),胃癌患者5年生存率僅為20%-30%。因此,尋找能夠影響胃癌進(jìn)展的分子信號(hào)通路,明確胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,對(duì)胃癌的早期診斷和研發(fā)中晚期胃癌的治療藥物具有十分重要的作用。TBX2屬于T-box gene(TBX)家族成員,從低等無脊椎動(dòng)物到人類等許多物種中廣泛存在。所有TBX轉(zhuǎn)錄因子都有一個(gè)保守的T-box結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域與特定的DNA序列結(jié)合,能夠發(fā)揮轉(zhuǎn)錄刺激或轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用。TBX2定位于人的17q23染色體,在上下肢,乳腺,肺臟,心臟,眼以及腎臟等組織器官的發(fā)育中具有重要作用。TBX2蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子,可以調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展、促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、抑制細(xì)胞凋亡,能夠在細(xì)胞分化前促進(jìn)前體細(xì)胞的增生和生存。近期的研究表明TBX2是可以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的癌基因,TBX2首先被發(fā)現(xiàn)在人乳腺癌細(xì)胞中存在過表達(dá),并且與乳腺癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。隨后大量研究表明TBX2過表達(dá)在多種人類腫瘤中普遍存在。TBX2能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,TBX2通過直接調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白Cdkn2a(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A)和p21等表達(dá)起到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用。另外,TBX2還與DNA損傷密切相關(guān),在BRCA1和BRCA2相關(guān)的乳腺癌中TBX2呈現(xiàn)擴(kuò)增,并且與DNA損傷應(yīng)答相關(guān)。TBX2可以促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移,在鼠乳腺癌模型中TBX2促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。然而,TBX2在胃癌中的臨床意義及生物學(xué)功能仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究TBX2蛋白在胃癌組織及正常胃組織的表達(dá)情況,分析其與臨床病理因素之間的相關(guān)性。檢測(cè)TBX2在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)含量,分析其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。同時(shí)探討TBX2在胃癌中發(fā)揮生物學(xué)作用時(shí)所依賴的分子機(jī)制。目的:分析胃癌組織中TBX2的表達(dá)量與臨床病理因素之間的關(guān)系。通過實(shí)驗(yàn)探討TBX2對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,證明TBX2是胃癌中重要的致癌基因,為診斷和治療胃癌提供新的靶點(diǎn)。方法:從2008-2010年在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)施手術(shù)并且術(shù)前未行任何放化療的患者中選取161例原發(fā)性胃癌樣本和10例正常胃組織。組織經(jīng)10%中性福爾馬林液固定、石蠟包埋。通過免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)分析胃癌組織中TBX2的表達(dá)量與臨床病理因素之間的關(guān)系。從ATCC和中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫購買胃癌細(xì)胞系BGC-823、SGC-7901、AGS、GES1、MKN-1。通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)技術(shù),實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫蛋白印跡雜交實(shí)驗(yàn)觀察TBX2在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)情況。通過細(xì)胞集落生成實(shí)驗(yàn)和MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染TBX2后胃癌細(xì)胞增殖情況。通過基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染TBX2后胃癌細(xì)胞侵襲情況。結(jié)果:TBX2在胃癌組織中過表達(dá):采用免疫組化方法檢測(cè)TBX2蛋白在161例胃癌標(biāo)本及10例正常胃組織中的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)TBX2蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均存在染色。在161例胃癌組織中,55.9%(90/161例)呈TBX2高表達(dá);而在正常胃組織中,僅呈TBX2陰性表達(dá)。TBX2蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理因素相關(guān)性:進(jìn)一步分析TBX2表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性,包括患者年齡,性別,組織分化程度,TNM分期等。我們發(fā)現(xiàn)TBX2的過表達(dá)與較高的TNM分期(p0.0001),腫瘤浸潤深度(T期)(p=0.0460)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.0051)顯著相關(guān)。但是卻沒有發(fā)現(xiàn)TBX2與其他因素存在顯著相關(guān)性。單因素回歸分析顯示TBX2表達(dá)、臨床分期和復(fù)發(fā)能顯著影響患者預(yù)后。Cox多因素回歸顯示分期和復(fù)發(fā)能獨(dú)立預(yù)測(cè)患者不良預(yù)后。生存曲線和Log-rank檢驗(yàn)顯示TBX2與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。TBX2促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲:通過western blot技術(shù)檢測(cè)胃癌細(xì)胞系中TBX2的內(nèi)源表達(dá)量發(fā)現(xiàn)BGC-823細(xì)胞系內(nèi)源表達(dá)量較高,而SGC-7901細(xì)胞系內(nèi)源表達(dá)量較低。通過TBX2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染以及siRNA干擾對(duì)這兩個(gè)細(xì)胞系分別進(jìn)行處理,結(jié)果顯示TBX2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后能夠顯著上調(diào)TBX2的mRNA以及相應(yīng)蛋白表達(dá)量,而siRNA干擾則能夠明顯下調(diào)TBX2的mRNA及蛋白表達(dá)量。通過MTT實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)TBX2轉(zhuǎn)染后能夠增強(qiáng)SGC-7901胃癌細(xì)胞系的增殖能力,而TBX2特異性siRNA干擾能夠明顯抑制BGC-823細(xì)胞的增殖能力。為了探究TBX2對(duì)于細(xì)胞侵襲所發(fā)揮的作用,進(jìn)行transwell實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TBX2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的侵襲能力顯著增強(qiáng),而TBX2干擾后細(xì)胞的侵襲能力降低(p0.05)。TBX2調(diào)控侵襲相關(guān)蛋白:通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)上調(diào)和抑制了TBX2的表達(dá),然后篩查與細(xì)胞增殖和侵襲密切相關(guān)的蛋白的表達(dá)變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與對(duì)照組細(xì)胞相比,TBX2過表達(dá)能夠顯著上調(diào)MMP2和MMP9蛋白的表達(dá)量,而TBX2干擾則抑制了這些蛋白的表達(dá)。結(jié)果說明TBX2可能通過MMP2或MMP9蛋白來調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。TBX2調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化:檢測(cè)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)因子的表達(dá)量,結(jié)果顯示TBX2過表達(dá)能夠下調(diào)SGC-7901細(xì)胞系中E-cadherin的含量水平,而TBX2干擾會(huì)稍許上調(diào)E-cadherin的表達(dá)量。能夠進(jìn)一步證實(shí)在胃癌細(xì)胞系中,TBX2能夠通過ERK-MMP-2信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞惡性表型的發(fā)生,同時(shí)可以加快細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化這一進(jìn)程。TBX2調(diào)控ERK信號(hào)通路:我們研究了MAPK信號(hào)通路:JNK,p38以及ERK,這些信號(hào)通路都是調(diào)控MMP-2表達(dá)的信號(hào)通路。我們發(fā)現(xiàn)TBX2過表達(dá)能夠顯著上調(diào)ERK的磷酸化水平,表明TBX2上調(diào)MMP-2的表達(dá)很有可能是通過誘導(dǎo)ERK信號(hào)通路的活化而進(jìn)行的。TBX2調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白:通過研究細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的變化情況。我們發(fā)現(xiàn)TBX2過表達(dá)能夠明顯上調(diào)cyclin E的表達(dá)水平,而敲除TBX表達(dá)則下調(diào)cyclin E的表達(dá)。另外TBX2轉(zhuǎn)染抑制了p21的表達(dá),而敲除TBX2表達(dá)會(huì)上調(diào)p21的表達(dá),表明TBX2上調(diào)細(xì)胞增殖很有可能是通過對(duì)p21的抑制和對(duì)cyclin E的上調(diào)來實(shí)現(xiàn)的。結(jié)論:在胃癌進(jìn)展過程,TBX2可以在人類胃癌組織中過量表達(dá)。TBX2過表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長和侵襲。TBX2通過ERK-MMP和EMT介導(dǎo)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。還可以通過下調(diào)p21蛋白表達(dá)和上調(diào)cyclin E蛋白表達(dá)介導(dǎo)細(xì)胞增殖。
【圖文】：

胃癌組織中TBX2蛋白質(zhì)的表達(dá)（放大倍數(shù),400X）

TBX2在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.2

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本文編號(hào)：2655682