【摘要】：研究背景:食管癌是全球第八大最常見的惡性腫瘤,在所有腫瘤中死亡率位居第六位。食管鱗狀細胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是食管癌最主要的組織學(xué)亞型。在發(fā)展中國家,約90%食管癌組織學(xué)類型為食管鱗癌。盡管近年來食管鱗癌的診斷方法及治療技術(shù)取得了極大的進步,食管鱗癌患者的5年生存率仍然低至5%-400%。牛痘相關(guān)激酶1(vaccinia-related kinase 1,VRK1)是絲氨酸-蘇氨酸激酶VRK家族中的一員,它主要參與細胞分裂,轉(zhuǎn)錄激活,DNA修復(fù)和組蛋白修飾。許多惡性腫瘤中都存在VRK1的異常上調(diào),高水平的VRK1常與腫瘤細胞高增殖活性相關(guān)。盡管先前研究表明VRK1在食管鱗癌中表達升高,但VRK1在食管鱗癌中所發(fā)揮的具體生物學(xué)功能仍然不清楚。本研究以VRK1在食管鱗癌中的作用及機制為主要方向,探討VRK1在食管鱗癌中的表達情況,分析其對食管鱗癌細胞生物學(xué)功能的影響,并進一步就VRK1參與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的具體機制進行研究。研究目的:本研究旨在探討VRK1在ESCC中的表達水平及對ESCC細胞的生物學(xué)行為的影響,進一步研究VRK1在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用及相關(guān)機制。為改善ESCC患者的預(yù)后、尋找新的基因靶點以及精確預(yù)后評估提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。材料與方法:1.病例選擇及標本收集;2.RNA提取及實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng);3.蛋白提取及蛋白免疫印跡;4.免疫免疫組織化學(xué)染色;5.細胞培養(yǎng);6.載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染;7.小RNA轉(zhuǎn)染;8.雙熒光素酶報告基因;9.Annexin V-PE/7AAD法檢測細胞凋亡;10.CCK-8實驗檢測細胞活性;11.Transwell細胞遷移及侵襲實驗;12.集落形成實驗;13.劃痕實驗;14.構(gòu)建食管鱗癌動物模型體內(nèi)檢測VRK1對食管鱗癌生長的影響;15.統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果:1.通過對41例ESCC患者組織樣本進行RT-PCR分析,結(jié)果表明VRK1在食管鱗癌組織中的表達水平顯著高于在癌旁正常組織(P0.01)。與食管正常表皮細胞(Her-la及HECC)相比,食管鱗癌細胞株(Eca109,Kyse150,Ec9706)中VRK1的表達水平顯著升高(P0.01)。半定量免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,在納入的132例食管鱗癌患者標本中,VRK1陽性率為59.84%(79/132例)。統(tǒng)計學(xué)分析顯示VRK1表達水平與腫瘤浸潤深度,淋巴結(jié)受累以及TNM分期相關(guān)(P0.01)。Kaplan-Meier和log-rank分析表明VRK1高表達與預(yù)后不良相關(guān)(P0.01)。單變量及多變量Cox回歸分析表明VRK1表達水平、T分期和N分期為ESCC的獨立預(yù)后因素(P0.01)。2.VRKl-RNAi慢病毒和陰性對照病毒分別轉(zhuǎn)染上述三種食管鱗癌細胞,與對照組相比,轉(zhuǎn)染了 VRK1 RNAi慢病毒的細胞增殖及集落形成能力明顯降低,凋亡增加,遷移和侵襲能力增強。相反,在食管鱗癌細胞中轉(zhuǎn)染VRK1過表達質(zhì)�？擅黠@增強細胞的增殖及集落形成能力,抑制細胞凋亡并促進細胞的遷移和侵襲。3.在食管鱗癌細胞中過表達VRK1顯著增加了細胞對順鉑的耐受性,而沉默VRK1使食管鱗癌細胞對順鉑變得敏感。裸鼠移植瘤實驗表明,與對照組相比,轉(zhuǎn)染VRK1 RNAi慢病毒的腫瘤細胞對順鉑敏感性明顯增高,而轉(zhuǎn)染了 VRK1過表達質(zhì)粒的腫瘤細胞對順鉑的耐藥性增強。4.免疫印跡實驗表明在食管鱗癌細胞中VRK1促進c-Jun的磷酸化。此外,磷酸化的c-Jun促進ESCC細胞增殖、抑制凋亡并降低細胞對順鉑的敏感性。靶向抑制c-Jun可阻斷VRK1對食管鱗癌細胞所施加的生物學(xué)效應(yīng)。5.免疫印跡實驗及RT-PCR表明在食管鱗癌細胞中沉默c-Jun可降低c-MYC的表達。此外,沉默VRK1抑制c-MYC的表達。雙熒光素報告系統(tǒng)實驗表明沉默c-Jun可顯著降低c-MYC啟動子的活性,提示c-Jun在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)c-MYC的表達。c-MYC減弱了食管鱗癌細胞對順鉑的敏感性。6.Luteolin(VRK1的抑制劑)可劑量依賴性地抑制食管鱗癌細胞的增殖、集落形成、侵襲及遷移并顯著促進細胞凋亡。Luteolin可抑制c-Jun的磷酸化并進而抑制c-MYC的表達。免疫印跡及CCK-8實驗表明,Luteolin可增強順鉑對食管鱗癌細胞的細胞毒作用。體內(nèi)實驗證實,Luteolin處理組小鼠腫瘤體積明顯小于生理鹽水處理組。7.對132例ESCC患者組織的免疫組織化學(xué)染色表明VRK1表達水平與c-MYC表達水平顯著相關(guān)(P0.001)。Kaplan-Meier分析顯示低VRK1/低c-MYC組患者的總生存期及無病生存期與其他組相比明顯較高,而高VRK1/高c-MYC組患者的預(yù)后較其他組相比明顯較差。研究結(jié)論:本研究表明VRK1在食管鱗癌中表達增高并且與臨床病理學(xué)特征密切相關(guān)。VRK1促進食管鱗癌細胞的增殖、侵襲并增強對順鉑的耐藥。VRK1可通過激活c-Jun上調(diào)c-MYC的表達,并通過c-Jun/c-MYC通路介導(dǎo)順鉑耐藥。VRK1的抑制劑可通過抑制VRK1在體內(nèi)、體外發(fā)揮抑制食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的作用。本研究首次闡明VRK1在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用,提示VRK1可作為靶向治療食管鱗癌的有效靶點。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.1

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本文編號：2655668