【摘要】：研究背景:食管癌是全球第八大最常見的惡性腫瘤,在所有腫瘤中死亡率位居第六位。食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是食管癌最主要的組織學(xué)亞型。在發(fā)展中國家,約90%食管癌組織學(xué)類型為食管鱗癌。盡管近年來食管鱗癌的診斷方法及治療技術(shù)取得了極大的進(jìn)步,食管鱗癌患者的5年生存率仍然低至5%-400%。牛痘相關(guān)激酶1(vaccinia-related kinase 1,VRK1)是絲氨酸-蘇氨酸激酶VRK家族中的一員,它主要參與細(xì)胞分裂,轉(zhuǎn)錄激活,DNA修復(fù)和組蛋白修飾。許多惡性腫瘤中都存在VRK1的異常上調(diào),高水平的VRK1常與腫瘤細(xì)胞高增殖活性相關(guān)。盡管先前研究表明VRK1在食管鱗癌中表達(dá)升高,但VRK1在食管鱗癌中所發(fā)揮的具體生物學(xué)功能仍然不清楚。本研究以VRK1在食管鱗癌中的作用及機(jī)制為主要方向,探討VRK1在食管鱗癌中的表達(dá)情況,分析其對食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,并進(jìn)一步就VRK1參與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)制進(jìn)行研究。研究目的:本研究旨在探討VRK1在ESCC中的表達(dá)水平及對ESCC細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響,進(jìn)一步研究VRK1在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用及相關(guān)機(jī)制。為改善ESCC患者的預(yù)后、尋找新的基因靶點(diǎn)以及精確預(yù)后評估提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。材料與方法:1.病例選擇及標(biāo)本收集;2.RNA提取及實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);3.蛋白提取及蛋白免疫印跡;4.免疫免疫組織化學(xué)染色;5.細(xì)胞培養(yǎng);6.載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染;7.小RNA轉(zhuǎn)染;8.雙熒光素酶報告基因;9.Annexin V-PE/7AAD法檢測細(xì)胞凋亡;10.CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活性;11.Transwell細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn);12.集落形成實(shí)驗(yàn);13.劃痕實(shí)驗(yàn);14.構(gòu)建食管鱗癌動物模型體內(nèi)檢測VRK1對食管鱗癌生長的影響;15.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:1.通過對41例ESCC患者組織樣本進(jìn)行RT-PCR分析,結(jié)果表明VRK1在食管鱗癌組織中的表達(dá)水平顯著高于在癌旁正常組織(P0.01)。與食管正常表皮細(xì)胞(Her-la及HECC)相比,食管鱗癌細(xì)胞株(Eca109,Kyse150,Ec9706)中VRK1的表達(dá)水平顯著升高(P0.01)。半定量免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,在納入的132例食管鱗癌患者標(biāo)本中,VRK1陽性率為59.84%(79/132例)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示VRK1表達(dá)水平與腫瘤浸潤深度,淋巴結(jié)受累以及TNM分期相關(guān)(P0.01)。Kaplan-Meier和log-rank分析表明VRK1高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)(P0.01)。單變量及多變量Cox回歸分析表明VRK1表達(dá)水平、T分期和N分期為ESCC的獨(dú)立預(yù)后因素(P0.01)。2.VRKl-RNAi慢病毒和陰性對照病毒分別轉(zhuǎn)染上述三種食管鱗癌細(xì)胞,與對照組相比,轉(zhuǎn)染了 VRK1 RNAi慢病毒的細(xì)胞增殖及集落形成能力明顯降低,凋亡增加,遷移和侵襲能力增強(qiáng)。相反,在食管鱗癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染VRK1過表達(dá)質(zhì)�？擅黠@增強(qiáng)細(xì)胞的增殖及集落形成能力,抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。3.在食管鱗癌細(xì)胞中過表達(dá)VRK1顯著增加了細(xì)胞對順鉑的耐受性,而沉默VRK1使食管鱗癌細(xì)胞對順鉑變得敏感。裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)表明,與對照組相比,轉(zhuǎn)染VRK1 RNAi慢病毒的腫瘤細(xì)胞對順鉑敏感性明顯增高,而轉(zhuǎn)染了 VRK1過表達(dá)質(zhì)粒的腫瘤細(xì)胞對順鉑的耐藥性增強(qiáng)。4.免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明在食管鱗癌細(xì)胞中VRK1促進(jìn)c-Jun的磷酸化。此外,磷酸化的c-Jun促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖、抑制凋亡并降低細(xì)胞對順鉑的敏感性。靶向抑制c-Jun可阻斷VRK1對食管鱗癌細(xì)胞所施加的生物學(xué)效應(yīng)。5.免疫印跡實(shí)驗(yàn)及RT-PCR表明在食管鱗癌細(xì)胞中沉默c-Jun可降低c-MYC的表達(dá)。此外,沉默VRK1抑制c-MYC的表達(dá)。雙熒光素報告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)表明沉默c-Jun可顯著降低c-MYC啟動子的活性,提示c-Jun在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)c-MYC的表達(dá)。c-MYC減弱了食管鱗癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。6.Luteolin(VRK1的抑制劑)可劑量依賴性地抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖、集落形成、侵襲及遷移并顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Luteolin可抑制c-Jun的磷酸化并進(jìn)而抑制c-MYC的表達(dá)。免疫印跡及CCK-8實(shí)驗(yàn)表明,Luteolin可增強(qiáng)順鉑對食管鱗癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),Luteolin處理組小鼠腫瘤體積明顯小于生理鹽水處理組。7.對132例ESCC患者組織的免疫組織化學(xué)染色表明VRK1表達(dá)水平與c-MYC表達(dá)水平顯著相關(guān)(P0.001)。Kaplan-Meier分析顯示低VRK1/低c-MYC組患者的總生存期及無病生存期與其他組相比明顯較高,而高VRK1/高c-MYC組患者的預(yù)后較其他組相比明顯較差。研究結(jié)論:本研究表明VRK1在食管鱗癌中表達(dá)增高并且與臨床病理學(xué)特征密切相關(guān)。VRK1促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲并增強(qiáng)對順鉑的耐藥。VRK1可通過激活c-Jun上調(diào)c-MYC的表達(dá),并通過c-Jun/c-MYC通路介導(dǎo)順鉑耐藥。VRK1的抑制劑可通過抑制VRK1在體內(nèi)、體外發(fā)揮抑制食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的作用。本研究首次闡明VRK1在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用,提示VRK1可作為靶向治療食管鱗癌的有效靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.1

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本文編號：2655668