【摘要】：肺癌是當(dāng)今世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重危害人類健康。肺癌可分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。非小細(xì)胞肺癌主要包括鱗癌、腺癌和大細(xì)胞癌,約占肺癌總數(shù)的85%。肺癌患者在早期一般少有明顯癥狀,確診時多數(shù)已經(jīng)處于中、晚期,其5年存活率不足15%。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療是提高肺癌患者生存率的有效方法。因此,尋找特異性和靈敏度高的腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物,研究其在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其分子機(jī)制具有至關(guān)重要的意義。microRNA(miRNA,miR)是具有調(diào)控功能的非編碼小分子RNA,長度大約為18-24個核苷酸,主要通過與靶基因mRNA的3'端非翻譯區(qū)(3'UTR)結(jié)合,導(dǎo)致翻譯抑制或者mRNA降解,從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。研究表明,microRNA的異常表達(dá)在腫瘤的形成、生長和轉(zhuǎn)移中起著重要作用,它既可作為癌基因,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,也可作為抑癌基因,保護(hù)機(jī)體免于癌癥的發(fā)生。有關(guān)microRNA與腫瘤關(guān)系的深入研究已受到生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的極大關(guān)注。因此,開展miRNAs與肺癌關(guān)系的研究,有望為肺癌的早期診治提供新的方案和新的靶點(diǎn)。miR-10a-5p是近年來發(fā)現(xiàn)的一個miRNA分子,有研究顯示miR-10a-5p作為癌基因在多種腫瘤(包括肺癌)的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用,且生物信息學(xué)提示GATA6和miR-10a-5p在多種生物物種中存在保守性綁定結(jié)合位點(diǎn)。GATA6(GATA binding protein 6)是進(jìn)化保守的GATA轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,它在胚胎發(fā)育過程中主要參與細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控。GATA家族共有六個分子:GATA1/2/3主要表達(dá)于造血系統(tǒng)細(xì)胞,GATA4/5/6則主要表達(dá)于中胚層和內(nèi)胚層來源的組織,如肺、心臟、消化道、肝臟等。近期研究報(bào)道GATA6對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到重要調(diào)控作用,并且在不同組織來源的腫瘤中表達(dá)變化和生物學(xué)作用亦不相同。非小細(xì)胞肺癌中miR-10a-5p是否能通過靶定GATA6基因影響肺癌的發(fā)生發(fā)展,值得進(jìn)一步研究。紫草素(shikonin)是從紫草科植物紫草部提取出的一種活性成分,它的化學(xué)結(jié)構(gòu)為萘醌類化合物,具有解毒、抗炎、抗菌、抗腫瘤等作用。紫草素可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。由于紫草素的毒性較強(qiáng)而其抗腫瘤作用不具特異性,未能在臨床上被推廣應(yīng)用。β-羥基異戊酰紫草素(β-hydroxyisovalerylshikon,β-HIVS)是天然存在的紫草素生物之一。研究發(fā)現(xiàn),β-HIVS可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和干擾腫瘤細(xì)胞周期等方式發(fā)揮其抑癌功效,具有成為新型高效低毒抗腫瘤藥物的潛力。本課題通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),研究miR-10a-5p與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,以及β-HIVS抗肺癌的分子作用機(jī)制,為尋找高靈敏性和特異性的肺癌診斷標(biāo)志物及臨床肺癌分子靶向治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。第一章 miR-10a-5p在非小細(xì)胞肺癌患者組織和血清中的表達(dá)及臨床意義目的:檢測非小細(xì)胞肺癌患者組織和血清中miR-l0a-5p表達(dá),探討其與臨床病理特征的關(guān)系。方法:(1)收集NSCLC患者血清標(biāo)本80份,健康志愿者血清75份。肺癌患者手術(shù)切除新鮮癌組織和癌旁組織20對。(2)通過qRT-PCR法檢測組織和血清中miR-l0a-5p的表達(dá)水平。(3)分析NSCLC患者組織和血清中miR-10a-5p表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系。(4)以受試者工作特征曲線評價(jià)miRNA-10a-5p用于診斷非小細(xì)胞肺癌的價(jià)值。結(jié)果:(1)NSCLC患者癌組織中miRNA-10a-5p表達(dá)水平明顯高于癌旁組織,NSCLC患者組血清miR-10a-5p表達(dá)高于健康對照組。(2)miR-10a-5p表達(dá)水平與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。(3)血清miR-10a-5p診斷NSCLC的曲線下面積(AUC)為0.709,其靈敏度和特異度分別為65.98%和72.71%。與癌胚抗原(CEA)的聯(lián)合診斷可提高診斷價(jià)值,AUC為0.801,敏感性為76.34%;特異性為79.26%。結(jié)論:miR-l0a-5p與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),有望成為非小細(xì)胞肺癌早期診斷的生物標(biāo)志物。第二章 miR-10a-5p對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響目的:探討miR-10a-5p對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)行為的影響。方法:(1)以正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B為對照,通過qRT-PCR技術(shù)檢測肺癌細(xì)胞株A549、H1650和H1299中miR-10a-5p的表達(dá)水平;選取miR-10a-5p高水平表達(dá)的細(xì)胞株作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究對象。(2)慢病毒感染A549細(xì)胞,下調(diào)細(xì)胞株中miR-l0a-5p的表達(dá)水平。(3)采用CCK8法、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell小室法檢測miR-10a-5p對肺癌A549細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移以及細(xì)胞周期的影響。(4)建立A549細(xì)胞裸鼠移植瘤模型,檢測miR-10a-5p對腫瘤生長的影響,檢測腫瘤體積、質(zhì)量等,繪制腫瘤生長曲線,并計(jì)算抑瘤率。結(jié)果:(1)肺癌細(xì)胞株A549中miR-10a-5p具有較高的表達(dá)水平。(2)慢病毒感染后,A549細(xì)胞中miR-10a-5p的表達(dá)水平明顯降低(P0.05)。(3)體外實(shí)驗(yàn)顯示,下調(diào)miR-10a-5p的表達(dá)能夠抑制A549細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞G1期向S期的發(fā)展、抑制細(xì)胞侵襲和遷移。(4)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示,下調(diào)miR-10a-5p的表達(dá)能夠顯著抑制肺癌裸鼠移植瘤的生長。結(jié)論:體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,miR-10a-5p作為癌基因,下調(diào)其表達(dá)水平可顯著抑制A549肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。第三章miR-10a-5p在非小細(xì)胞肺癌中的靶基因及其作用機(jī)制目的:研究miR-1 Oa-5p在NSCLC中的靶基因、分子通路及其作用機(jī)制。方法:(1)利用生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-10a-5p的靶基因。(2)采用雙熒光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證miR-10a-5p對所預(yù)測靶基因是否具有直接靶向調(diào)控作用。(3)采用免疫組化法檢測NSCLC患者癌組織、癌旁組織以及裸鼠移植瘤中靶基因的表達(dá)情況。(4)Western blot和qRT-PCR技術(shù)檢測miR-10a-5p對靶基因及其下游基因的蛋白和mRNA的表達(dá)影響。結(jié)果:(1)生物學(xué)信息提示,miR-10a-5p在多種生物中與GATA6的3'UTR區(qū)存在保守性結(jié)合位點(diǎn)。(2)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明,miR-10a-5p可直接靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子GATA6基因。(3)免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,肺癌組織中GATA6表達(dá)低于癌旁組織,下調(diào)miR-10a-5p組裸鼠移植瘤中的GATA6表達(dá)明顯高于空白對照組和陰性對照組。(4)下調(diào)A549細(xì)胞miR-10a-5p表達(dá)后,細(xì)胞中GATA6蛋白和mRNA的表達(dá)水平升高,EGFR、CTNNB1蛋白和mRNA的表達(dá)水平降低。結(jié)論:miR-10a-5p對非小細(xì)胞肺癌作用機(jī)制可能與靶向調(diào)控GATA6基因,進(jìn)而激活EGFR和Wnt信號通路相關(guān)第四章 β-羥基異戊酰紫草素對A549肺癌細(xì)胞的生長抑制作用及其分子機(jī)制目的:研究β-羥基異戊酰紫草素(β-HIVS)對人肺癌A549細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,并對其機(jī)制進(jìn)行初步探討。方法:(1)體外實(shí)驗(yàn):①以不同濃度的β-HIVS處理A549肺癌細(xì)胞。②采用CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell小室法檢測β-HIVS對細(xì)胞增殖、周期、凋亡及侵襲和遷移的影響。③qRT-PCR技術(shù)和Western blot法檢測β-HIVS對A549細(xì)胞中miR-10a-5p表達(dá)影響,及GATA6、EGFR、CTNNB1、P53、Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)的影響。(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):①建立人肺癌裸鼠移植瘤模型,隨機(jī)分為對照組,β-HIVS低、中、高劑量(10、20、40mg/kg)組和紫杉醇(30mg/kg)組;②各組予以腹腔注射給藥,每次0.2mL,每周2次,連續(xù)用藥4周;③檢測裸鼠腫瘤體積、瘤質(zhì)量等,繪制腫瘤生長曲線,并計(jì)算抑瘤率。TUNEL法檢測β-HIVS處理后各組移植瘤組織中細(xì)胞凋亡情況;④免疫組化法、Western blot和qRT-PCR技術(shù)檢測β-HIVS對移植瘤組織中miR-10a-5p、GATA6、EGFR、CTNNB1、P53、Bcl-2蛋白和mRNA的表達(dá)的影響。結(jié)果:(1)體外實(shí)驗(yàn)①β-HIVS能夠抑制A549肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移,阻滯細(xì)胞G1期向S期發(fā)展。②β-HIVS上調(diào)p53蛋白和mRNA表達(dá),下調(diào)Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá),且具有呈濃度依賴性。③β-HIVS作用A549細(xì)胞前后,miR-l0a-5p和GATA6表達(dá)沒有明顯改變(P0.05)。(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)①β-HIVS能夠呈劑量依賴性抑制肺癌裸鼠移植瘤生長,能明顯縮小腫瘤體積。②TUNEL法顯示,與對照組相比β-HIVS處理后腫瘤細(xì)胞凋亡明顯增多。③免疫組化、Western blot和qRT-PCR結(jié)果顯示,β-HIVS處理后移植瘤組織中p53蛋白及mRNA表達(dá)升高,而Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)降低。結(jié)論:β-羥基異戊酰紫草素能抑制非小細(xì)胞肺癌生長,作用機(jī)制可能與通過調(diào)節(jié)p53和Bcl-2表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)。研究結(jié)果對開發(fā)適宜中藥制劑或有效成份實(shí)施肺癌分子靶向治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2
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本文編號：
2655019
