【摘要】：研究背景胃癌(Gastric carcinoma,GC)是世界范圍內(nèi)發(fā)生率排名第四的惡性腫瘤,其死亡率占所有癌癥死亡的第二位。曲妥珠單抗(Trastuzumab,商品名Herceptin)是一種靶向作用于人表皮生長因子受體2(Hunman epidermal growth factor receptor2,HER2)的人源化單克隆抗體,主要通過拮抗HER2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的傳遞而發(fā)揮抑制腫瘤細胞生長的作用。與單純化療相比,曲妥珠單抗聯(lián)合化療顯著延長了 HER2陽性晚期胃癌患者的生存期。但是,曲妥珠單抗耐藥嚴重影響了胃癌患者的臨床療效。目前,曲妥珠單抗耐藥現(xiàn)象已成為胃癌臨床治療亟需解決的重要問題之一。近年來的研究證實,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)與腫瘤耐藥關(guān)系密切。在細胞缺氧、糖供應(yīng)不足、鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡等情況下,腫瘤細胞均可引發(fā)ERS,并通過激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR),增強自身對損傷的抗性及其存活能力。作為一種內(nèi)源性的細胞適應(yīng)性保護機制,ERS可參與調(diào)控腫瘤細胞耐藥,但其在胃癌曲妥珠單抗耐藥中的作用及其機制尚不清楚。mircroRNA是一種內(nèi)源性基因調(diào)節(jié)因子,對腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展及耐藥具有重要的調(diào)節(jié)作用,并且廣泛參與ERS的信號調(diào)節(jié)通路。在腫瘤微環(huán)境中,外泌體作為miRNAs的重要載體,可防止其降解。此外,外泌體作為細胞間信號交流的一種形式,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及耐藥性的傳遞密切相關(guān)。本課題擬重點探討ERS在胃癌曲妥珠單抗耐藥發(fā)生與傳遞中的作用及其機制。內(nèi)容和方法1.HER2陽性胃癌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型建立:以ERS激活劑Thapsigargin(TG)或無糖培養(yǎng)基(-Glu/FBS)分別處理HER2陽性胃癌細胞株,處理后不同時間點以Western blot檢測GRP78的蛋白表達。2.CCK8法檢測不同狀態(tài)胃癌細胞對曲妥珠單抗的敏感性差異。3.microRNA芯片篩選平臺技術(shù)對正常狀態(tài)胃癌細胞及其在ERS狀態(tài)下的miRNA表達譜進行差異篩選。4.采用陽離子脂質(zhì)體法進行細胞瞬時轉(zhuǎn)染miRNA抑制劑或陰性對照,轉(zhuǎn)染48h后加用TG處理,CCK8法檢測細胞對曲妥珠單抗的敏感性變化。5.采用超速離心法進行外泌體的分離純化;透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài);顆粒粒度分析儀檢測外泌體數(shù)量和大小分布;Western blot檢測外泌體表面標(biāo)志性蛋白CD63和CD81的蛋白表達。6.以不同狀態(tài)胃癌細胞來源的外泌體孵育受體胃癌細胞,CCK8法檢測受體細胞對曲妥珠單抗敏感性的變化。7.實時熒光定量 PCR 法(Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR QRT-PCR)檢測細胞或外泌體中miRNA的表達水平。8.Western Blot 法檢測細胞 GPR78、ERK、p-ERK、AKT 和 p-AKT 蛋白的表達水平。9.統(tǒng)計學(xué)方法:實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVAtest),兩組間比較采用t'檢驗(two-tailed Student's t-test)。P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.ERS狀態(tài)下HER2陽性胃癌細胞對曲妥珠單抗的敏感性顯著降低。2.ERS狀態(tài)下HER2陽性胃癌細胞的miRNA表達發(fā)生顯著變化;篩選其中表達顯著升高的11條miRNA,以相應(yīng)的miRNA inhibitor下調(diào)其表達;結(jié)果發(fā)現(xiàn),通過下調(diào)miR-301a-3p的表達,ERS誘導(dǎo)產(chǎn)生的曲妥珠單抗耐藥性明顯減弱,p-ERK和p-AKT蛋白表達在曲妥珠單抗的作用下明顯下調(diào);而GRP78的表達并不受miR-301a-3p表達水平的影響。3.經(jīng)ERS狀態(tài)HER2陽性胃癌細胞的培養(yǎng)液上清或ERS狀態(tài)HER2陽性胃癌細胞釋放的外泌體孵育后,受體細胞對曲妥珠單抗的敏感性顯著降低,GRP78的表達未升高,p-ERK和p-AKT蛋白表達在曲妥珠單抗的作用下未出現(xiàn)下調(diào)。4.ERS狀態(tài)下HER2陽性胃癌細胞釋放的外泌體,其miR-301a-3p表達水平顯著升高;經(jīng)ERS狀態(tài)細胞釋放的外泌體處理后,受體胃癌細胞的miR-301a-3p表達水平顯著升高;經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-301a-3p inhibitor的ERS狀態(tài)胃癌細胞來源的外泌體孵育后,受體細胞對曲妥珠單抗不產(chǎn)生耐藥性。結(jié)論1.ERS誘導(dǎo)HER2陽性胃癌細胞對曲妥珠單抗產(chǎn)生耐藥。2.ERS通過miR-301a-3p的過表達參與調(diào)控HER2陽性胃癌細胞對曲妥單抗的耐藥。3.ERS狀態(tài)HER2陽性胃癌細胞通過釋放外泌體將耐藥性傳遞至受體胃癌細胞。4.ERS狀態(tài)HER2陽性胃癌細胞釋放的外泌體通過轉(zhuǎn)運miR-301a-3p的方式傳遞耐藥性。
【圖文】：

ＧＲＰ７８的蛋白表達水平在１２ｈ明顯升高；－Ｇｌｕ／ＦＢＳ作用胃癌細胞ＮＣＩ－Ｎ８７逡逑０、６、１２、２４及４８ｈ后，ＧＲＰ７８的蛋白表達水平在２４ｈ明顯升高。提示ＴＧ和逡逑－Ｇｌｕ／ＦＢＳ激活胃癌細胞產(chǎn)生ＥＲＳ的最佳時間點分別為１２ｈ和２４ｈ邋（圖１－１，卜逡逑２）。逡逑ＴＧ（１邋ＪＩＭ）邋Ｏｈ邋３ｈ邋６ｈ邋１２ｈ邐２４ｈ逡逑ＧＲＰ７８邐■＝邋ＴＯＭ逡逑｜ｉ－Ａｃｔｉｎ逡逑ＮＣＩ－Ｎ８７逡逑圖丨－１．邋ＴＧ處理胃癌細胞ＮＣＩ－Ｎ８７不同時間后ＧＲＰ７８蛋白表達水平逡逑－Ｇｌｕ／ＦＢＳ邋Ｏｈ邋６ｈ邋１２ｈ邐２４ｈ邐４８ｈ逡逑ＧＲＰ７８邐？．逡逑ｐ－Ａｃｔｉｎ逡逑ＮＣＩ－Ｎ８７逡逑圖１－２．邋－Ｇｌｕ／ＦＢＳ處理胃癌細胞ＮＣ１－Ｎ８７不同時間后ＧＲＰ７８蛋白表達水平逡逑１．３＿２邋ＴＧ或－Ｇｌｕ／ＦＢＳ激活胃癌細胞產(chǎn)生ＥＲＳ的持續(xù)時間逡逑為明確胃癌細胞激活ＥＲＳ后，ＥＲＳ反應(yīng)可持續(xù)的T間，ＴＧ（邋１邋ｐｍ）或－Ｇｌｕ／ＦＢＳ逡逑分別作用細胞１２ｈ或２４ｈ后，更換正常培養(yǎng)基，于不同時間點收集細胞蛋白，以逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ檢測ＧＲＰ７８的表達水平。逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ結(jié)果顯示：ＴＧ或－Ｇｌｕ／ＦＢＳ激活胃癌細胞ＮＣＩ－Ｎ８７產(chǎn)生ＥＲＳ逡逑后２４、４８、７２及２９６ｈ，ＧＲＰ７８的蛋白表達水平仍明顯升高（圖１－３，１－４）。逡逑１４逡逑

與正常態(tài)胃癌細胞相比，，處于ＥＲＳ狀態(tài)的胃癌細胞對曲妥珠逡逑單抗的敏感性顯著降低，即耐藥性增加，提示ＥＲＳ可誘導(dǎo)胃癌細胞對曲妥珠單逡逑抗產(chǎn)生耐藥（圖１－５，１－６）。逡逑１５逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2

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本文編號：2655018