【摘要】：胰腺癌(Pancreatic adenocarcinoma,PAC)發(fā)病隱匿,進(jìn)展迅速,治療效果和預(yù)后極差,發(fā)病率和死亡率呈平行增長趨勢。目前認(rèn)為胰腺癌是一種多因素疾病,是癌細(xì)胞、微環(huán)境與機體(包括遺傳、代謝、免疫等)相互作用的復(fù)雜過程。雖然對胰腺癌的流行病學(xué)、發(fā)病機制和診斷治療有了更深的認(rèn)識,但各種治療方法的效果有限,主要是由于胰腺的特殊性、早期發(fā)現(xiàn)和手術(shù)切除的困難、化療效果不佳。近30年來,胰腺癌形成的分子機制研究、生物靶向治療、機體內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運的改善以及免疫系統(tǒng)的調(diào)控發(fā)展迅速。然而,KRAS的研究并未取得顯著的效果,恢復(fù)TP53等抑制基因也難以實現(xiàn),靶向治療療效仍不盡人意。針對人類胰腺癌的治療仍然是一個很大的挑戰(zhàn)。因此,針對胰腺癌的發(fā)病機制、早期診斷、藥物篩選、治療策略及預(yù)測復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方向的探索已然成為當(dāng)今的熱點研究方向之一。卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白 34(Coiled-coil domain containing 34,CCDC34)是一種可以編碼蛋白的疾病相關(guān)基因,也被稱為NY-REN-41、RAMA3或L15。近期,陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)CCDC34在數(shù)種惡性腫瘤中呈高表達(dá)水平,包括腎細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌(non-small-celllungcancer,NSCLC)和膀胱癌,并且與腫瘤的增殖、凋亡及血管生成等有關(guān)。本課題組近期采用生物信息學(xué)的方法對癌癥公共數(shù)據(jù)庫Oncomine和TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測分析:與正常對照組相比,CCDC34 mRNA在胰腺癌中顯著高表達(dá),并且高表達(dá)的CCDC34mRNA與血管生成相關(guān)指標(biāo)(VEGF、CD31等)顯著相關(guān),因此在研究中,我們重點驗證及探索CCDC34在胰腺癌血管生成中的作用及其臨床預(yù)后意義,以期為尋找胰腺癌治療的新靶點、新策略提供理論依據(jù)。第一部分CCDC34在胰腺癌中的表達(dá)水平及其臨床預(yù)后意義目的:近期有研究發(fā)現(xiàn)CCDC34具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的特點。本研究旨在比較胰腺癌與正常胰腺組織中CCDC34的表達(dá)差異,并探索CCDC34的表達(dá)水平在胰腺癌患者中的預(yù)后意義。方法:首先利用Oncomine和癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫初步預(yù)測CCDC34的表達(dá)和預(yù)后價值;而后采用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測胰腺腺癌組織樣品(N =90)和配對的癌旁胰腺組織(N =90)中CCDC34蛋白的表達(dá)水平;最后,分別應(yīng)用Kaplan-Meier單因素生存分析和Cox多因素生存分析探索CCDC34表達(dá)水平在胰腺癌中的預(yù)后價值。結(jié)果:Oncomine和TCGA數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn):與正常胰腺組織相比,胰腺癌組織中CCDC34 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P0.05),且CCDC34 mRNA表達(dá)水平升高的胰腺癌患者總生存期顯著低于正常對照組(P=0.031)。免疫組化顯示:與配對的癌旁組織相比,胰腺癌組織中CCDC34蛋白的表達(dá)水平顯著增高(P=0.000),并且高表達(dá)CCDC34的胰腺癌患者總生存期比CCDC34低表達(dá)的胰腺癌患者總生存期顯著降低(P=0.000)。Kaplan-Meier單因素生存分析和Cox多因素生存分析證實:CCDC34高表達(dá)水平是胰腺癌患者預(yù)后不良的獨立預(yù)測因子(P值均=0.000)。結(jié)論:CCDC34在胰腺癌中顯著高表達(dá),并且高表達(dá)的CCDC34是預(yù)測胰腺癌患者預(yù)后不良的獨立預(yù)測因素。第二部分CCDC34與胰腺癌血管生成指標(biāo)的關(guān)系及潛在機制研究目的:在第一部分研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討和驗證CCDC34與胰腺癌血管生成的關(guān)系及其可能機制。方法:首先下載TCGA數(shù)據(jù)庫中的胰腺癌數(shù)據(jù),分析CCDC34和PI3K/AKT信號通路中的關(guān)鍵分子(PIK3CA、AKT1、mTOR、HIF1A、VEGFA和 PECAM1)mRNA表達(dá)水平及其相互關(guān)系。隨后,采用免疫組化的方法在胰腺癌標(biāo)本中檢測上述指標(biāo)的蛋白表達(dá)水平,并分析CCDC34表達(dá)與上述指標(biāo)的相關(guān)性。最后利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot方法檢測PI3K/AKT信號通路中關(guān)鍵分子的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示:與正常對照組相比,胰腺癌中CCDC34基因和 PI3K/AKT 信號通路關(guān)鍵分子(PIK3CA、AKTI、mTOR、HIF1A、VEGFA和PECAM1)的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P值均0.05)。隨后的免疫組化檢測數(shù)據(jù)與預(yù)測結(jié)果一致。同時,生物信息學(xué)結(jié)果顯示:胰腺癌中CCDC34和PI3K/AKT通路的關(guān)鍵分子(PIK3CA、AKT1、mTOR、HIF1A、VEGFA 和 PECAM1)呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為:CCDC34與PIK3CA(R=0.24,P=0.0012)、CCDC34與 AKT1(R=0.29,P =6.6e-05)、CCDC34 與 mTOR(R =0.24,P =0.0015)、CCDC34與 HIF1A(=0.15,P =0.041)、CCDC34 與 VEGFA(R =0· 19,P =0.011)及 CCDC34與PECAM1(R=0.17,P=0.026)。隨后的免疫組化結(jié)果顯示:CCDC34與VEGF及MVD計數(shù)均呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.464和0.378(P值均為0.000);CCDC34高表達(dá)組的MVD值顯著高于CCDC34低表達(dá)組(P0.001)。此外,qRT-PCR和Western blot驗證了 CCDC34的高表達(dá)可能通過激活PI3K/AKT途徑促成胰腺癌的血管生成。結(jié)論:胰腺癌中CCDC34與PI3K/AKT通路中的關(guān)鍵分子(PIK3CA、AKT1、mTOR、HIF1A、VEGFA和PECAM1)的表達(dá)呈正相關(guān),提示高表達(dá)的CCDC34可能通過激活PI3K/AKT信號通路促進(jìn)胰腺癌的血管生成。第三部分CCDC34對胰腺癌細(xì)胞功能學(xué)作用的影響及分子機制目的:在前兩部分的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討CCDC34對胰腺癌細(xì)胞功能學(xué)作用的影響及分子機制。方法:我們選擇3株胰腺癌細(xì)胞株(BxPC-3、PANC-1和SW1990)和1株正常胰腺導(dǎo)管細(xì)胞株HPDE6-C7,分別檢測CCDC34在上述細(xì)胞株中的基礎(chǔ)表達(dá)量;然后選擇表達(dá)量最高的PANC-1作為工具細(xì)胞株,利用RNA干擾技術(shù)對PANC-1中的CCDC34進(jìn)行沉默,而后行細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡、克隆形成及血管形成功能學(xué)實驗;利用全基因組表達(dá)譜篩選技術(shù)對沉默與未沉默CCDC34的PANC-1細(xì)胞株篩選差異表達(dá)基因,采用DAVID網(wǎng)站進(jìn)行KEGG通路富集分析,western blot方法對通路關(guān)鍵分子進(jìn)行了相關(guān)驗證。結(jié)果:與對照組比較,CCDC34沉默組的胰腺癌細(xì)胞增殖和克隆形成數(shù)量明顯減少,細(xì)胞周期被阻滯在G2/M期,凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多,血管形成能力明顯減弱(P值均0.001)。其次,全基因表達(dá)譜分析顯示:沉默CCDC34后總共有410個基因發(fā)生了顯著的表達(dá)變化(P值均0.05),其中有218個基因上調(diào),192個基因下調(diào)。隨后,David在線工具富集顯示:在排名前10位的富集通路中,PI3K/AKT信號通路富集最為顯著。最后,western blot實驗證實:沉默CCDC34后PI3K及AKT水平變化不顯著,而p-PI3K和p-AKT水平明顯減低。結(jié)論:沉默CCDC34可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、克隆形成及血管生成,促進(jìn)其細(xì)胞凋亡,其機制可能與CCDC34對PI3K/AKT信號通路的調(diào)控有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.9

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1 齊偉;CCDC34在胰腺癌血管生成中的作用及其預(yù)后意義[D];山東大學(xué);2018年

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本文編號：2655071