【摘要】：超級增強子(super enhancer,SE)是具有強大活性增強子的一個大簇,通常含有數(shù)個組分增強子區(qū)域,較普通增強子體量更大且更能驅(qū)動控制細胞身份基因等重要基因的表達,進化上趨向于存于與發(fā)育相關(guān)的重要基因附近,通常在20kbp以內(nèi),且有CTCF區(qū)域形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)以限制其增強功能作用于特定靶基因,在發(fā)育和腫瘤等疾病發(fā)生過程中起到重要作用。通過生物信息學(xué)的方法,本課題在多種腫瘤細胞系中篩選出以H3K27ac和H3K4me1的高水平組蛋白修飾為首要標志,輔以CTCF成環(huán)預(yù)測,鑒別出多個潛在的腫瘤特異性超級增強子。隨后我們通過CRISPR-CAS9基因編輯技術(shù)敲除了位于PLAU基因上游的超級增強子片段,隨即發(fā)現(xiàn)敲除該片段特異性降低PLAU(u-pa)的表達,并引起了Hela細胞的一系列生理特性變化,包括增殖率降低,遷移及侵襲性明顯下降,對胞外基質(zhì)的親和力上升,對順鉑的敏感度上升等。通過CRISRPCas9技術(shù),進一步明確了該超級增強子的組分位置及各個組分的活性強度,在獲得敲除最高轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域的細胞系后,后續(xù)的裸鼠成瘤及腫瘤染色均表明該區(qū)域的缺失會降低Hela細胞在體內(nèi)的惡性程度并使腫瘤細胞對順鉑的敏感度增加,提示該區(qū)域是一個潛在的抗腫瘤靶向區(qū)域。最后,通過染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)的方法檢測了Hela細胞在低氧和順鉑處理情況下該超級增強子的活性變化,發(fā)現(xiàn)低氧條件(5%O2,36h)誘導(dǎo)該超級增強子活性提高,而順鉑處理(4μg/ml,48h)使該區(qū)域活性降低,提示低氧條件可能部分通過活化超級增強子來增加腫瘤細胞的惡性程度,順鉑則可能部分通過降低超級增強子的活性來抑制腫瘤細胞的惡性生長。結(jié)論:人宮頸癌細胞通過特異性激活超級增強子PLAU-SE提高細胞增殖、遷移、侵襲及耐藥能力,且低氧刺激會加強PLAU-SE的活性。PLAU-SE敲除會降低上述細胞惡性表現(xiàn),是一個有潛在應(yīng)用價值的靶向位點。
【圖文】：

1.2.1 SE 的定義通過在全基因組水平的生物信息學(xué)分析，Young 等人通過分析 Key-TFS（關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子）和中間復(fù)合體的結(jié)合點，在小鼠 ES 細胞內(nèi)首次提出了超級增強子的概念，即一串具有強大促轉(zhuǎn)錄功能的增強子集合。利用高通量染色質(zhì)免疫互作結(jié)果，Young 等人分析了與控制細胞分化方向密切相關(guān)的數(shù)個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的共同結(jié)合位點，根據(jù)其所在位置共鑒定出了 8800 個增強子區(qū)域，而在這 8800 個增強子區(qū)域內(nèi)，有 231 個增強子與轉(zhuǎn)錄中間復(fù)合體的結(jié)合密度遠高于剩余增強子。后續(xù)的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些具有同中間復(fù)合體高密度結(jié)合的增強子還存在以下特性，即：高水平的組蛋白修飾（H3K27ac，H3K4me1），高水平的染色質(zhì)修飾（p300），和高水平的 DNaseI Hypersensitivity Clusters 集合。超級增強子與中間復(fù)合體的結(jié)合模式如圖 1-1 所示。具有這些特質(zhì)的增強子在結(jié)構(gòu)上常常與控制細胞分化狀態(tài)和分化方向的重要基因相關(guān)聯(lián)，為了表明這一類增強子的特殊性，Young 等人將其稱為超級增強子（SE）[6-8]。

哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)論文的的幾個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域進行高通量染色質(zhì)免疫互作測序分析，在獲得序列后，挑選出其共同結(jié)合區(qū)域分析，若這些與關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的增強子區(qū)域在基因組水平上臨近（間距小于 12.5kb），則拼接為一個增強子串，，接著分析增強子串和單一增強子與中間復(fù)合體的結(jié)合水平，依照其強度繪制曲線圖，人為劃定曲線斜率高于 1 的為超級增強子，低于 1 的為普通增強子。由于-2 為生物信息學(xué)方法鑒定超級增強子的流程圖。由于超級增強子在不同細胞、不同時期內(nèi)激活狀態(tài)呈現(xiàn)顯著差異，且不同重要基因所需要的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子各不相同，在無法得知某一重要基因最需要的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子是什么時，這種方法并不適用[13-19]，鑒于此，Abranham等人通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在增強子共有的分子標識中，H3K27ac 為置信度最高的標志。利用 H3K27ac 的豐度，聯(lián)合考慮增強子體量，可較為準確地初篩超級增強子[6-8]。本實驗室的劉洪波博士已于前期構(gòu)建了基于體量和各分子標記豐度預(yù)測多個細胞系內(nèi)特異性活化的超級增強子的方法和網(wǎng)站 SEA，其結(jié)果發(fā)表于NAR 上[20]
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q78;R73

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本文編號：2654686