發(fā)布時(shí)間：2020-05-08 09:40

【摘要】：目的構(gòu)建表達(dá)C端截短HBX基因和蛋白的人肝癌HepG2細(xì)胞模型,并探討其對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響。方法1.以肝癌組織中HBX常見(jiàn)的整合片段HBXΔ32(C端缺失32個(gè)氨基酸的HBX,全長(zhǎng)369bp)、HBXΔ4(C端缺失4個(gè)氨基酸的HBX,全長(zhǎng)453bp)和野生型HBX(全長(zhǎng)465bp)為目的片段,分別構(gòu)建腺病毒載體并轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。以轉(zhuǎn)染后的LV5-HBXΔ32、LV5-HBXΔ4、LV5-HBX細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組,LV5-NC(空病毒)和HepG2細(xì)胞為對(duì)照組探討C端截短HBX對(duì)HepG2細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。2.采用qPCR和WB的方法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞HBX基因和蛋白的表達(dá)情況,判斷轉(zhuǎn)染是否成功。3.在培養(yǎng)基中加入CCK8,分別于1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)后檢測(cè)并比較各組細(xì)胞OD值,探討C端截短HBX對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響。4.采用transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的侵襲和遷移能力,探討C端截短HBX對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲和遷移的影響。5.采用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞凋亡的情況,探討C端截短HBX對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果1.本研究成功構(gòu)建了表達(dá)C端截短HBX基因和蛋白的HepG2細(xì)胞,鏡下可觀察到GFP綠色熒光信號(hào),經(jīng)qPCR和WB驗(yàn)證有HBX mRNA和蛋白的表達(dá)。2.HBXΔ32、HBXΔ4、HBX、NC、HepG2各組細(xì)胞之間的增殖能力有差異,每個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)其OD值差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均0.05)。經(jīng)兩兩比較發(fā)現(xiàn),每個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)HBXΔ32和HBXΔ4組細(xì)胞OD值均高于其他各組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均0.05),而HBXΔ32和HBXΔ4組之間細(xì)胞的OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.HBXΔ32、HBXΔ4、HBX、NC、HepG2各組發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)分別為277.89±20.64、266.78±22.09、163.44±21.02、157.78±22.02和160.56±21.51,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。經(jīng)兩兩比較發(fā)現(xiàn),HBXΔ32和HBXΔ4組侵襲細(xì)胞數(shù)均高于其他各組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均0.05),而HBXΔ32和HBXΔ4組之間侵襲細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.856)。4.HBXΔ32、HBXΔ4、HBX、NC、HepG2各組發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)分別為95.22±16.84、94.44±12.99、66.56±9.50、71.00±8.79和69.78±9.71,各組之間遷移細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。經(jīng)兩兩比較發(fā)現(xiàn),HBXΔ32和HBXΔ4組遷移細(xì)胞數(shù)均高于其他各組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均0.05),而HBXΔ32和HBXΔ4組之間遷移細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.588)。5.HBXΔ32、HBXΔ4、HBX、NC、HepG2各組之間細(xì)胞凋亡率分別為1.43±0.522%、1.14±0.236%、1.06±0.033%、1.26±0.466%、1.24±0.653%,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.505)。結(jié)論C端截短的HBXΔ32、HBXΔ4對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力有一定的促進(jìn)作用,并未發(fā)現(xiàn)其對(duì)HepG2細(xì)胞的凋亡有影響。HBX C端的后4-32個(gè)氨基酸可能不是影響肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的主要功能域。本研究初步解釋了C端截短的HBX基因的整合在廣西肝癌高發(fā)區(qū)肝癌發(fā)病中所起的作用,為HBV相關(guān)性HCC的病因?qū)W探討和綜合防治提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論參考。
【圖文】：

C 端截短 HBX 對(duì) HepG2 細(xì)胞生物學(xué)活性的影響 碩士學(xué)位結(jié) 果1. 腺病毒結(jié)構(gòu)和測(cè)序結(jié)果1.1 腺病毒結(jié)構(gòu)該腺病毒由上海生工生物工程股份有限公司構(gòu)建，，結(jié)構(gòu)如圖 3-1所示腺病毒的穿梭質(zhì)粒為 LV5，該質(zhì)粒包含表達(dá)綠色熒光蛋白的 GFP 基因以及呤霉素和氨芐青霉素抗性基因（后續(xù)篩選實(shí)驗(yàn)需要），啟動(dòng)子為 CMV 和 Eα ,酶切位點(diǎn)為 NotI/NsiI。

C 端截短 HBX 對(duì) HepG2 細(xì)胞生物學(xué)活性的影響 碩士學(xué)位論文1.2 測(cè)序結(jié)果該腺病毒構(gòu)建完成后由上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果如圖 3-2、3-3、3-4 所示。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：2654488