【摘要】：目的:研究miR-21通過調(diào)控PTEN對(duì)自噬的影響。進(jìn)一步探討miR-21調(diào)節(jié)的自噬對(duì)膀胱癌細(xì)胞凋亡、增殖的作用及可能的機(jī)制。為剖析miR-21對(duì)細(xì)胞自噬以及膀胱癌的影響奠定基礎(chǔ)。方法:1.miR-21通過調(diào)控PTEN對(duì)自噬的影響。培養(yǎng)人膀胱T24細(xì)胞,并構(gòu)建以質(zhì)粒為載體轉(zhuǎn)染的miR-21基因沉默T24細(xì)胞(m i R-21 inhibitor組)、mir-21基因過表達(dá)T24細(xì)胞(miR-21 mimics組)為實(shí)驗(yàn)組,以質(zhì)粒空載體轉(zhuǎn)染的T24細(xì)胞(miR-21 mimics-NC、miR-21 inhibitor-NC)為陰性對(duì)照組以及另外兩組未轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞(Blank control)為空白對(duì)照組,轉(zhuǎn)染48h后,采用miRNA Realtime、RT-PCR和Western Blot分別從m RNA和蛋白水平檢測(cè)各組細(xì)胞的miR-21、PTEN和自噬相關(guān)蛋白beclin 1、LC3-II,探討miR-21通過PTEN調(diào)節(jié)自噬發(fā)揮作用的可能機(jī)制。2.研究miR-21通過PTEN介導(dǎo)細(xì)胞自噬對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖和凋亡的影響甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法查看各組T24細(xì)胞的增殖變化情況。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)分析細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期;并用RT-PCR和Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)水平,觀察miR-21通過PTEN介導(dǎo)不同細(xì)胞自噬水平對(duì)細(xì)胞增殖凋亡的影響。結(jié)果:1.miR-21通過調(diào)控PTEN對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞自噬的影響本研究結(jié)果表明在干預(yù)4h后與陰性對(duì)照、空白對(duì)照組相比較,miR-21-mimic干預(yù)的T24細(xì)胞miR-21 m RNA明顯增加而PTEN和LC3-Ⅱ、beclin 1 m RNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低,差異均具有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);同時(shí)與對(duì)照組相比較,miR-21-inhibitor干預(yù)的T24細(xì)胞miR-21 m RNA明顯降低而PTEN和LC3-Ⅱ、becli 1 m RNA和蛋白表達(dá)水平明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。2.研究miR-21通過PTEN介導(dǎo)細(xì)胞自噬對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖和凋亡的影響運(yùn)用MTT法對(duì)不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)(0h、24h和48h)的膀胱癌T24細(xì)胞活性進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組對(duì)比,予miR-21-mimic干預(yù)的T24細(xì)胞活性呈現(xiàn)對(duì)時(shí)間的依賴性增長(zhǎng),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。與對(duì)照組相對(duì)比,予miR-21-i nhibitor干預(yù)的T24細(xì)胞活性呈現(xiàn)對(duì)時(shí)間依賴性下降,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。同時(shí)miR-21-mimic干預(yù)的T24細(xì)胞中cyclin D1表達(dá)量上升,說明促進(jìn)細(xì)胞增殖。其次我們用流式細(xì)胞儀觀察到,與空白對(duì)照組和miR-21-mimic組比較,miR-21-inhibitor組凋亡率顯著升高(P0.01),同時(shí)Caspase-3表達(dá)量上升,說明Caspase-3被激活,細(xì)胞凋亡被誘導(dǎo)。此外通過FCM檢測(cè)各組細(xì)胞周期,發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照Blank control和陰性對(duì)照miR-21 mimics-NC相比,miR-21 mimics組的G1期細(xì)胞增多,G2期的細(xì)胞顯著減少(**P0.01),提示細(xì)胞發(fā)生了G1期阻滯,說明上調(diào)miR-21使細(xì)胞周期阻滯在G1期。同樣的下調(diào)miR-21使細(xì)胞發(fā)生了G2期阻滯。結(jié)論:1)miR-21在膀胱癌細(xì)胞中可能通過調(diào)控PTEN的表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬。2)miR-21通過PTEN介導(dǎo)的細(xì)胞自噬,對(duì)膀胱癌細(xì)胞呈現(xiàn)促進(jìn)增殖抑制凋亡的表現(xiàn)。
【圖文】：

第四章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果第四章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1 miR-21 mimics 和 inhibitor 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染膀胱癌 T24 細(xì)胞后熒光表達(dá)情況于熒光顯微鏡下觀察各組膀胱癌 T24 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染 48h 后熒光表達(dá)情況,陰性對(duì)照組 miR-21 mimics-NC、陰性對(duì)照組 miR-21 inhibitor-NC 及 miR-21 mimics、miR-21inhibitor 組均可見大量綠色熒光，表明目的質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入 T24 細(xì)胞內(nèi)，可檢測(cè)各組 T24 細(xì)胞中的 miR-21 表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)：

圖 2 miR-21 inhibitor-NC、miR-21 inhibitor 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)(10×20)FIG. 2 mir-21 inhibitor-NC and mir-21 inhibitor transfection efficiency detection(10×20).4.2 miRNA Realtime 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果4.2.1 實(shí)驗(yàn)分組NO： 樣本 NO： 樣本1 A，Blank control 4 A，Blank control2 B，miR-21 mimics-NC 5 B，miR-21 inhibitor-NC3 C，，miR-21 mimics 6 C，miR-21 inhibitor4.2.2 轉(zhuǎn)染后各組膀胱癌 T24 細(xì)胞中 miR-21 的表達(dá)轉(zhuǎn)染上調(diào)組（miR-21 mimics）及陰性對(duì)照組（miR-21 mimics-NC）、空白對(duì)照組（Blank control）miR-21 相對(duì)表達(dá)量分別為 1.0219±0.0365、1.0629±0.0479、2.0699±0.1011。上調(diào)組 mi R-21 表達(dá)水平則明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.14

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2648708