【摘要】：目的:研究miR-21通過調控PTEN對自噬的影響。進一步探討miR-21調節(jié)的自噬對膀胱癌細胞凋亡、增殖的作用及可能的機制。為剖析miR-21對細胞自噬以及膀胱癌的影響奠定基礎。方法:1.miR-21通過調控PTEN對自噬的影響。培養(yǎng)人膀胱T24細胞,并構建以質粒為載體轉染的miR-21基因沉默T24細胞(m i R-21 inhibitor組)、mir-21基因過表達T24細胞(miR-21 mimics組)為實驗組,以質�？蛰d體轉染的T24細胞(miR-21 mimics-NC、miR-21 inhibitor-NC)為陰性對照組以及另外兩組未轉染T24細胞(Blank control)為空白對照組,轉染48h后,采用miRNA Realtime、RT-PCR和Western Blot分別從m RNA和蛋白水平檢測各組細胞的miR-21、PTEN和自噬相關蛋白beclin 1、LC3-II,探討miR-21通過PTEN調節(jié)自噬發(fā)揮作用的可能機制。2.研究miR-21通過PTEN介導細胞自噬對膀胱癌T24細胞增殖和凋亡的影響甲基偶氮唑藍(MTT)法查看各組T24細胞的增殖變化情況。流式細胞術(FCM)檢測分析細胞凋亡率和細胞周期;并用RT-PCR和Western Blot檢測各組細胞周期蛋白cyclin D1和細胞凋亡相關蛋白Caspase-3的表達水平,觀察miR-21通過PTEN介導不同細胞自噬水平對細胞增殖凋亡的影響。結果:1.miR-21通過調控PTEN對膀胱癌T24細胞自噬的影響本研究結果表明在干預4h后與陰性對照、空白對照組相比較,miR-21-mimic干預的T24細胞miR-21 m RNA明顯增加而PTEN和LC3-Ⅱ、beclin 1 m RNA和蛋白表達水平明顯降低,差異均具有有統(tǒng)計學意義(P0.05);同時與對照組相比較,miR-21-inhibitor干預的T24細胞miR-21 m RNA明顯降低而PTEN和LC3-Ⅱ、becli 1 m RNA和蛋白表達水平明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P均0.05)。2.研究miR-21通過PTEN介導細胞自噬對膀胱癌T24細胞增殖和凋亡的影響運用MTT法對不同時間節(jié)點(0h、24h和48h)的膀胱癌T24細胞活性進行測定,發(fā)現(xiàn)與對照組對比,予miR-21-mimic干預的T24細胞活性呈現(xiàn)對時間的依賴性增長,差異均有統(tǒng)計學意義(P均0.05)。與對照組相對比,予miR-21-i nhibitor干預的T24細胞活性呈現(xiàn)對時間依賴性下降,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P均0.05)。同時miR-21-mimic干預的T24細胞中cyclin D1表達量上升,說明促進細胞增殖。其次我們用流式細胞儀觀察到,與空白對照組和miR-21-mimic組比較,miR-21-inhibitor組凋亡率顯著升高(P0.01),同時Caspase-3表達量上升,說明Caspase-3被激活,細胞凋亡被誘導。此外通過FCM檢測各組細胞周期,發(fā)現(xiàn)與空白對照Blank control和陰性對照miR-21 mimics-NC相比,miR-21 mimics組的G1期細胞增多,G2期的細胞顯著減少(**P0.01),提示細胞發(fā)生了G1期阻滯,說明上調miR-21使細胞周期阻滯在G1期。同樣的下調miR-21使細胞發(fā)生了G2期阻滯。結論:1)miR-21在膀胱癌細胞中可能通過調控PTEN的表達,調節(jié)細胞自噬。2)miR-21通過PTEN介導的細胞自噬,對膀胱癌細胞呈現(xiàn)促進增殖抑制凋亡的表現(xiàn)。
【圖文】：

第四章 實驗結果第四章 實驗結果4.1 miR-21 mimics 和 inhibitor 瞬時轉染膀胱癌 T24 細胞后熒光表達情況于熒光顯微鏡下觀察各組膀胱癌 T24 細胞，轉染 48h 后熒光表達情況,陰性對照組 miR-21 mimics-NC、陰性對照組 miR-21 inhibitor-NC 及 miR-21 mimics、miR-21inhibitor 組均可見大量綠色熒光，表明目的質粒已成功轉入 T24 細胞內，可檢測各組 T24 細胞中的 miR-21 表達情況。轉染效率檢測：

圖 2 miR-21 inhibitor-NC、miR-21 inhibitor 轉染效率檢測(10×20)FIG. 2 mir-21 inhibitor-NC and mir-21 inhibitor transfection efficiency detection(10×20).4.2 miRNA Realtime 實驗檢測結果4.2.1 實驗分組NO： 樣本 NO： 樣本1 A，Blank control 4 A，Blank control2 B，miR-21 mimics-NC 5 B，miR-21 inhibitor-NC3 C，，miR-21 mimics 6 C，miR-21 inhibitor4.2.2 轉染后各組膀胱癌 T24 細胞中 miR-21 的表達轉染上調組（miR-21 mimics）及陰性對照組（miR-21 mimics-NC）、空白對照組（Blank control）miR-21 相對表達量分別為 1.0219±0.0365、1.0629±0.0479、2.0699±0.1011。上調組 mi R-21 表達水平則明顯高于空白對照組和陰性對照組
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.14

【參考文獻】

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本文編號：2648708