【摘要】：背景與目的:肝癌(HCC)是世界上第六大惡性腫瘤,其死亡率較高。在我國部分偏遠地區(qū)特別是南方沿海地區(qū)的農(nóng)村中占第二位,僅次于胃癌。肝硬化是HCC發(fā)生的基礎,HCC患者每年新增病例、全球發(fā)病率不斷增加。目前HCC的臨床治療面臨巨大瓶頸問題:絕大多數(shù)患者喪失了手術治療時機,而且,不管作為手術后化療、以及非手術病人的保守治療,都必須以化療作為主要的、唯一的臨床治療措施。但是,目前臨床化療藥物由于以下兩點而呈現(xiàn)療效不佳、毒性巨大、多藥抗藥性(MDR)建立迅速的巨大瓶頸。造成這種問題的根本原因主要也有兩條:一是大多數(shù)藥物沒有癌細胞/組織靶向性,或者靶向性不足;二是這些藥物不能有效地抑制MDR的形成。以上原因造成目前藥物治療效果較差、毒性巨大的臨床化療特征,特別是HCC這樣高度惡性的腫瘤患者臨床治愈率(即臨床標準的生存期)低下和短期死亡率的居高不下!根據(jù)以上所述,如何提高目前臨床抗癌一線化療藥物的靶向性和抗MDR特性是癌癥特別是HCC未來新一代化療藥物發(fā)展的有效途徑和希望。阿霉素(Doxorubicin,DOX)是目前臨床常用的作用于DNA的一線廣譜抗腫瘤藥,該藥由于具有強大的癌細胞殺傷能力被認為是最有效的HCC化療藥物之一,但是,DOX巨大的毒性特別是心臟以及其他增殖性細胞的毒性十分突出。后來研發(fā)并上市了數(shù)種品牌的DOX脂質(zhì)體(Lipo-DOX),該藥由于易于與細胞膜融合而大大提高了 DOX在細胞內(nèi)的濃度,從而明顯增強了 DOX對癌細胞的殺傷效率。但是,由于該藥沒有明顯的靶向性而使其毒性仍然很強烈,也會很快建立MDR。因此,解決靶向性、MDR逆轉問題是包括Lipo-DOX在內(nèi)的化療藥物亟待解決的問題,也是目前癌癥臨床取得突破性進展的有效途徑之一�；谏鲜霭邢蛐浴DR逆轉問題,設計了如下藥物載體體系并完成了其體外藥效的部分實驗。我們前期篩選得到了 HCC靶向性12肽HCSP4,并進行了一系列包括臨床標本在內(nèi)的體內(nèi)外人HCC細胞/組織特異性和敏感性驗證,結果顯示HCSP4對HCC具有非常良好的結合特異性和敏感性,所以,完全可以以HCSP4作為導向元件解決HCC靶向性問題!關于抗MDR也就是MDR逆轉問題,結合文獻和我們自己的數(shù)據(jù)庫分析預測,認為一種miRNA(具體名稱暫時不便公開)具有可以逆轉化療藥物MDR的潛力,我們成功的以這種miRNA的前體(pre-miRNA)構建了其質(zhì)粒表達載體。本研究以上述多肽、miRNA構建靶向HCC的具有MDR逆轉特征的DOX脂質(zhì)體載藥體系(HCSP4-Lipo-miRNA-DOX),設想這種體系可能具有HCC高度的靶向性、明顯的MDR逆轉特征,從而達到DOX高效低毒、無或弱MDR的HCC治療效果!這種設計本身具有很高的理論基礎和原創(chuàng)性,也非常符合目前世界范圍內(nèi)癌癥臨床的實際需要。對制備的HCSP4-Lipo-miRNA-DOX通過粒徑、分散系數(shù)、藥物包封率、靶向性檢測等進行脂質(zhì)體特性研究,結果顯示達到了預期要求的特性范圍。為了研究HCSP4-Lipo-miRNA-DOX對HCC的治療效應,并評估其DOX的MDR逆轉能力,本研究在HCSP4-Lipo-miRNA-DOX轉染細胞后,研究該脂質(zhì)體載藥體系對人HCC細胞HepG2和DOX耐受性人HCC細胞HepG2/ADR的細胞毒性、增殖力、運動力、凋亡的生物學效應,特別以HepG2/ADR的上述檢測結果來評估其對HCC細胞DOX的MDR逆轉效應。方法:1.以mirbase(http://www.mirbase.org)在線確定目標miRNA的前體序列,設計插入片段,通過合成、退火,將其插入pcDNA6.2-GW載體中,得到pcDNA6.2-GW/miRNA。2.以薄膜超聲分散法制備HCSP4修飾的脂質(zhì)體,用硫酸銨pH梯度法裝載DOX藥物,利用陽離子脂質(zhì)體與負電荷質(zhì)粒相互作用的性質(zhì)連接miRNA,得到一種新型HCSP4靶向的miRNA阿霉素脂質(zhì)體,HCSP4-Lipo-miRNA-DOX。3.應用激光粒度儀、透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡、熒光分光光度計等技術檢測新型脂質(zhì)體HCSP4-Lipo-miRNA-DOX的藥物包封率高及其他脂質(zhì)體特性。4.將 pcDNA6.2-GW/EmGFP 質(zhì)粒代替 pcDNA6.2-GW/miRNA 對HCSP4-Lipo-miRNA-DOX體系的轉染效率進行優(yōu)化,通過轉染人胃癌SGC7901和人肝癌HepG2對HCSP4靶向性進行評估。5.將 HCSP4-Lipo-miRNA-DOX 轉入 HepG2 和 HepG2/ADR,以野生細胞和HCSP4-Lipo-DOX作為對照,應用MTT法、損傷修復法、流式細胞儀、細胞和核染色等技術檢測HCSP4-Lipo-miRNA-DOX對HepG2和HepG2/ADR的細胞殺傷力、增殖、運動、凋亡的影響。6.對于該miRNA可能靶向的若干與MDR形成相關的基因表達進行了檢測,實驗取得巨大成功,獲得了 HCSP4-Lipo-miRNA-DOX逆轉MDR的初步的分子機理!該部分結果、內(nèi)容將在師妹繼續(xù)本研究后續(xù)研究的資料內(nèi)陳述,本論文不包括該部分內(nèi)容陳述。結果:1.成功構建了目標miRNA表達質(zhì)粒,測序正確。2.成功制備了 HCSP4-Lipo-miRNA-DOX體系,檢測其DOX藥物包封率高(90%)、脂質(zhì)體形狀呈球形,大小均一,分布均勻,粒徑是± 130nm,符合未來體內(nèi)應用要求。3.HCSP4-Lipo-miRNA-DOX 體系轉染 HepG2 細胞,轉染效率80%,HCSP4 導向的脂質(zhì)體靶向性良好。4.MTT、損傷修復法、DAPI染色、考馬斯亮藍染色、細胞平板克隆、流式細胞儀結果提示HCSP4-Lipo-miRNA-DOX脂質(zhì)體本身為較安全的生物材料,其對HepG2和HepG2/ADR細胞的殺傷力明顯增強,明顯強化了 DOX抑制細胞的增殖、遷移能力,促進了 DOX促使HCC細胞的凋亡過程,并將細胞周期阻滯于G1期。結論:初步實驗結果表明HCSP4-Lipo-miRNA-DOX脂質(zhì)體載藥體系是一種新型的HCC特異的治療藥物靶向遞送載體體系,HCSP4-Lipo-miRNA-DOX對HepG2細胞的殺傷力強于HCSP4-Lipo-DOX,對HepG2/ADR細胞的殺傷力顯著強于HCSP4-Lipo-DOX。根據(jù)上述實驗結果,HCSP4-Lipo-miRNA-DOX具有良好的HCC體外治療效應,更重要的是具有HCC治療過程中DOX的MDR形成的顯著抑制作用,使DOX藥物能持續(xù)發(fā)揮其殺傷效果,這對于提高DOX臨床對HCC的治療效應、降低毒性、抑制HCC治療后復發(fā)率等,都具有十分重要的意義和誘人社會經(jīng)濟效益!HCSP4-Lipo-miRNA-DOX的設計具有世界范圍內(nèi)的原創(chuàng)性,我們的上述初步研究結果提示其對HCC的治療具有重要價值,值得我們后續(xù)繼續(xù)強化研究。同時,本實驗設計和結果對于其他癌癥種類及化療藥物的改造研發(fā)都具有重要的借鑒意義。
【圖文】：

ＨＣＣ的發(fā)生是一個多級步驟的過程，預示著在細胞分化和增殖過程中存在異逡逑常，并且持續(xù)存在一個異常的血管生成。調(diào)g⑾鄭罰埃梗埃サ模齲茫貌』頰嘰嬖諑義閑愿尾�、肝硬化祼冷Z媳塵埃芤ⅲ齲茫玫奈Ｏ找蛩兀ㄍ跡保保┌ㄒ韻錄父齜藉義廈媯魄茍舅兀粒疲攏�、乙肝病肚Gǎ齲攏鄭�、丙肝病肚Gǎ齲茫鄭�、緫{愿尾　⒋義閑晃陜搖⒎逝趾頭薔憑災拘愿窩椎穆愿腥鏡�。一些遗传变异与人类｝x茫糜繡義瞎兀ǔ；蚋謀淶賈氯舊澹模危戀牡檬В�，哉槼些扰f邇虻任換蚨у義希ǎ蹋希齲郟罰藎職┗蠔橢擄┗蟯槐洹２煌∫蛞⒌模齲茫彌�，常仕G父鐾揪隊板義舷歟ǎ遙攏蓖揪丁ⅲ穡擔場荊福萃揪兌約埃祝睿敉揪兜�。｝x茫靡種蘋潁穡擔車耐槐洌阱義轄玻埃サ模齲茫沒疾≌咧械玫街な擔庵滯槐湓誆煌乩砦恢玫鬧琢鮒型槐淥俁儒義希卞義

本文編號：2648707