【摘要】：背景與目的:肝癌(HCC)是世界上第六大惡性腫瘤,其死亡率較高。在我國(guó)部分偏遠(yuǎn)地區(qū)特別是南方沿海地區(qū)的農(nóng)村中占第二位,僅次于胃癌。肝硬化是HCC發(fā)生的基礎(chǔ),HCC患者每年新增病例、全球發(fā)病率不斷增加。目前HCC的臨床治療面臨巨大瓶頸問(wèn)題:絕大多數(shù)患者喪失了手術(shù)治療時(shí)機(jī),而且,不管作為手術(shù)后化療、以及非手術(shù)病人的保守治療,都必須以化療作為主要的、唯一的臨床治療措施。但是,目前臨床化療藥物由于以下兩點(diǎn)而呈現(xiàn)療效不佳、毒性巨大、多藥抗藥性(MDR)建立迅速的巨大瓶頸。造成這種問(wèn)題的根本原因主要也有兩條:一是大多數(shù)藥物沒(méi)有癌細(xì)胞/組織靶向性,或者靶向性不足;二是這些藥物不能有效地抑制MDR的形成。以上原因造成目前藥物治療效果較差、毒性巨大的臨床化療特征,特別是HCC這樣高度惡性的腫瘤患者臨床治愈率(即臨床標(biāo)準(zhǔn)的生存期)低下和短期死亡率的居高不下!根據(jù)以上所述,如何提高目前臨床抗癌一線化療藥物的靶向性和抗MDR特性是癌癥特別是HCC未來(lái)新一代化療藥物發(fā)展的有效途徑和希望。阿霉素(Doxorubicin,DOX)是目前臨床常用的作用于DNA的一線廣譜抗腫瘤藥,該藥由于具有強(qiáng)大的癌細(xì)胞殺傷能力被認(rèn)為是最有效的HCC化療藥物之一,但是,DOX巨大的毒性特別是心臟以及其他增殖性細(xì)胞的毒性十分突出。后來(lái)研發(fā)并上市了數(shù)種品牌的DOX脂質(zhì)體(Lipo-DOX),該藥由于易于與細(xì)胞膜融合而大大提高了 DOX在細(xì)胞內(nèi)的濃度,從而明顯增強(qiáng)了 DOX對(duì)癌細(xì)胞的殺傷效率。但是,由于該藥沒(méi)有明顯的靶向性而使其毒性仍然很強(qiáng)烈,也會(huì)很快建立MDR。因此,解決靶向性、MDR逆轉(zhuǎn)問(wèn)題是包括Lipo-DOX在內(nèi)的化療藥物亟待解決的問(wèn)題,也是目前癌癥臨床取得突破性進(jìn)展的有效途徑之一�；谏鲜霭邢蛐浴DR逆轉(zhuǎn)問(wèn)題,設(shè)計(jì)了如下藥物載體體系并完成了其體外藥效的部分實(shí)驗(yàn)。我們前期篩選得到了 HCC靶向性12肽HCSP4,并進(jìn)行了一系列包括臨床標(biāo)本在內(nèi)的體內(nèi)外人HCC細(xì)胞/組織特異性和敏感性驗(yàn)證,結(jié)果顯示HCSP4對(duì)HCC具有非常良好的結(jié)合特異性和敏感性,所以,完全可以以HCSP4作為導(dǎo)向元件解決HCC靶向性問(wèn)題!關(guān)于抗MDR也就是MDR逆轉(zhuǎn)問(wèn)題,結(jié)合文獻(xiàn)和我們自己的數(shù)據(jù)庫(kù)分析預(yù)測(cè),認(rèn)為一種miRNA(具體名稱暫時(shí)不便公開(kāi))具有可以逆轉(zhuǎn)化療藥物MDR的潛力,我們成功的以這種miRNA的前體(pre-miRNA)構(gòu)建了其質(zhì)粒表達(dá)載體。本研究以上述多肽、miRNA構(gòu)建靶向HCC的具有MDR逆轉(zhuǎn)特征的DOX脂質(zhì)體載藥體系(HCSP4-Lipo-miRNA-DOX),設(shè)想這種體系可能具有HCC高度的靶向性、明顯的MDR逆轉(zhuǎn)特征,從而達(dá)到DOX高效低毒、無(wú)或弱MDR的HCC治療效果!這種設(shè)計(jì)本身具有很高的理論基礎(chǔ)和原創(chuàng)性,也非常符合目前世界范圍內(nèi)癌癥臨床的實(shí)際需要。對(duì)制備的HCSP4-Lipo-miRNA-DOX通過(guò)粒徑、分散系數(shù)、藥物包封率、靶向性檢測(cè)等進(jìn)行脂質(zhì)體特性研究,結(jié)果顯示達(dá)到了預(yù)期要求的特性范圍。為了研究HCSP4-Lipo-miRNA-DOX對(duì)HCC的治療效應(yīng),并評(píng)估其DOX的MDR逆轉(zhuǎn)能力,本研究在HCSP4-Lipo-miRNA-DOX轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,研究該脂質(zhì)體載藥體系對(duì)人HCC細(xì)胞HepG2和DOX耐受性人HCC細(xì)胞HepG2/ADR的細(xì)胞毒性、增殖力、運(yùn)動(dòng)力、凋亡的生物學(xué)效應(yīng),特別以HepG2/ADR的上述檢測(cè)結(jié)果來(lái)評(píng)估其對(duì)HCC細(xì)胞DOX的MDR逆轉(zhuǎn)效應(yīng)。方法:1.以mirbase(http://www.mirbase.org)在線確定目標(biāo)miRNA的前體序列,設(shè)計(jì)插入片段,通過(guò)合成、退火,將其插入pcDNA6.2-GW載體中,得到pcDNA6.2-GW/miRNA。2.以薄膜超聲分散法制備HCSP4修飾的脂質(zhì)體,用硫酸銨pH梯度法裝載DOX藥物,利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體與負(fù)電荷質(zhì)粒相互作用的性質(zhì)連接miRNA,得到一種新型HCSP4靶向的miRNA阿霉素脂質(zhì)體,HCSP4-Lipo-miRNA-DOX。3.應(yīng)用激光粒度儀、透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡、熒光分光光度計(jì)等技術(shù)檢測(cè)新型脂質(zhì)體HCSP4-Lipo-miRNA-DOX的藥物包封率高及其他脂質(zhì)體特性。4.將 pcDNA6.2-GW/EmGFP 質(zhì)粒代替 pcDNA6.2-GW/miRNA 對(duì)HCSP4-Lipo-miRNA-DOX體系的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行優(yōu)化,通過(guò)轉(zhuǎn)染人胃癌SGC7901和人肝癌HepG2對(duì)HCSP4靶向性進(jìn)行評(píng)估。5.將 HCSP4-Lipo-miRNA-DOX 轉(zhuǎn)入 HepG2 和 HepG2/ADR,以野生細(xì)胞和HCSP4-Lipo-DOX作為對(duì)照,應(yīng)用MTT法、損傷修復(fù)法、流式細(xì)胞儀、細(xì)胞和核染色等技術(shù)檢測(cè)HCSP4-Lipo-miRNA-DOX對(duì)HepG2和HepG2/ADR的細(xì)胞殺傷力、增殖、運(yùn)動(dòng)、凋亡的影響。6.對(duì)于該miRNA可能靶向的若干與MDR形成相關(guān)的基因表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè),實(shí)驗(yàn)取得巨大成功,獲得了 HCSP4-Lipo-miRNA-DOX逆轉(zhuǎn)MDR的初步的分子機(jī)理!該部分結(jié)果、內(nèi)容將在師妹繼續(xù)本研究后續(xù)研究的資料內(nèi)陳述,本論文不包括該部分內(nèi)容陳述。結(jié)果:1.成功構(gòu)建了目標(biāo)miRNA表達(dá)質(zhì)粒,測(cè)序正確。2.成功制備了 HCSP4-Lipo-miRNA-DOX體系,檢測(cè)其DOX藥物包封率高(90%)、脂質(zhì)體形狀呈球形,大小均一,分布均勻,粒徑是± 130nm,符合未來(lái)體內(nèi)應(yīng)用要求。3.HCSP4-Lipo-miRNA-DOX 體系轉(zhuǎn)染 HepG2 細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率80%,HCSP4 導(dǎo)向的脂質(zhì)體靶向性良好。4.MTT、損傷修復(fù)法、DAPI染色、考馬斯亮藍(lán)染色、細(xì)胞平板克隆、流式細(xì)胞儀結(jié)果提示HCSP4-Lipo-miRNA-DOX脂質(zhì)體本身為較安全的生物材料,其對(duì)HepG2和HepG2/ADR細(xì)胞的殺傷力明顯增強(qiáng),明顯強(qiáng)化了 DOX抑制細(xì)胞的增殖、遷移能力,促進(jìn)了 DOX促使HCC細(xì)胞的凋亡過(guò)程,并將細(xì)胞周期阻滯于G1期。結(jié)論:初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HCSP4-Lipo-miRNA-DOX脂質(zhì)體載藥體系是一種新型的HCC特異的治療藥物靶向遞送載體體系,HCSP4-Lipo-miRNA-DOX對(duì)HepG2細(xì)胞的殺傷力強(qiáng)于HCSP4-Lipo-DOX,對(duì)HepG2/ADR細(xì)胞的殺傷力顯著強(qiáng)于HCSP4-Lipo-DOX。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,HCSP4-Lipo-miRNA-DOX具有良好的HCC體外治療效應(yīng),更重要的是具有HCC治療過(guò)程中DOX的MDR形成的顯著抑制作用,使DOX藥物能持續(xù)發(fā)揮其殺傷效果,這對(duì)于提高DOX臨床對(duì)HCC的治療效應(yīng)、降低毒性、抑制HCC治療后復(fù)發(fā)率等,都具有十分重要的意義和誘人社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益!HCSP4-Lipo-miRNA-DOX的設(shè)計(jì)具有世界范圍內(nèi)的原創(chuàng)性,我們的上述初步研究結(jié)果提示其對(duì)HCC的治療具有重要價(jià)值,值得我們后續(xù)繼續(xù)強(qiáng)化研究。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果對(duì)于其他癌癥種類及化療藥物的改造研發(fā)都具有重要的借鑒意義。
【圖文】：

ＨＣＣ的發(fā)生是一個(gè)多級(jí)步驟的過(guò)程，預(yù)示著在細(xì)胞分化和增殖過(guò)程中存在異逡逑常，并且持續(xù)存在一個(gè)異常的血管生成。調(diào)g⑾鄭罰埃梗埃サ模齲茫貌』頰嘰嬖諑義閑愿尾　⒏斡不惱鋃媳塵�，能引发｝x茫玫奈Ｏ找蛩兀ㄍ跡保保┌ㄒ韻錄父齜藉義廈媯魄茍舅兀粒疲攏薄⒁腋尾《荊ǎ齲攏鄭�、丙肝病肚Gǎ齲茫鄭⒕憑愿尾�、代辶x閑晃陜搖⒎逝趾頭薔憑災(zāi)拘愿窩椎穆愿腥鏡取Ｒ恍┮糯湟煊肴死啵齲茫糜繡義瞎�，通常基因钢\淶賈氯舊澹模危戀牡檬�，，哉槼些扰f邇虻任換蚨у義希ǎ蹋希齲郟罰藎職┗蠔橢擄┗蟯槐�。不同病因引发的｝x茫彌校Ｊ薌父鐾揪隊(duì)板義舷歟ǎ遙攏蓖揪�、７w擔(dān)場(chǎng)荊福萃揪兌約埃祝睿敉揪兜�。｝x茫靡種蘋潁穡擔(dān)車耐槐�，在辶x轄玻埃サ模齲茫沒(méi)疾≌咧械玫街な擔(dān)庵滯槐湓誆煌乩砦恢玫鬧琢鮒型槐淥俁儒義希卞義

本文編號(hào)：2648707