【摘要】：目的:建立胰腺癌miRNA差異表達(dá)譜,探討miR-196b在胰腺癌惡性進(jìn)展中的作用機(jī)制。方法:1.隨機(jī)選取三對胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞癌及癌旁組織,通過Illumina二代高通量測序平臺Hise-2500對胰腺癌組和癌旁組織樣本的mi RNA進(jìn)行深度測序分析,篩選出miRNA差異表達(dá)譜;2.應(yīng)用相關(guān)軟件和網(wǎng)站對顯著差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析,分析出有研究價值的目標(biāo)miRNA,并進(jìn)一步分析目標(biāo)miRNA(hsa-mir-196b)與胰腺導(dǎo)管內(nèi)上皮細(xì)胞癌病理分級及臨床分期的關(guān)系;RT-PCR擴(kuò)大樣本量(15對)驗證hsa-mir-196b在癌及癌旁組織間的差異表達(dá)。3.探索hsa-mir-196b對胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用,應(yīng)用雙熒光素酶報告基因法和Western Blot驗證HOX B6是其下游靶基因,并探討HOX B6在胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞癌和癌旁組織中的表達(dá)與胰腺癌的臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果:1.胰腺癌和癌旁組織miRNA表達(dá)存在差異;高通量測序分析發(fā)現(xiàn),3對胰腺癌和癌旁組織共存在579種已知的獨立的已知miRNA,發(fā)現(xiàn)差異顯著的miRNA中篩選出表達(dá)差異表達(dá)的miRNA共計133個。最終,篩選出在各組中表達(dá)穩(wěn)定并且表達(dá)差異高的已知miRNA表達(dá)上調(diào)mi RNA(2個):hsa-mir-31;hsa-mir-196b;表達(dá)下調(diào)miRNA(6個):hsa-mir-148a;hsa-mir-141;hsa-mir-217;hsa-mir-216b;hsa-mir-802;hsa-mir-216a。2.hsa-mir-196b與腫瘤患者的生存相關(guān)性最佳,且與腫瘤的組織學(xué)分級、病理分期、M分期、T分期均相關(guān)(p0.05);采用RT-PCR對15對胰腺癌和癌旁組織hsa-mir-196b表達(dá)進(jìn)行驗證。與癌旁組織比較,has-miR-196b在胰腺癌組中的表達(dá)顯著上調(diào),與測序結(jié)果一致,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。3.hsa-miR-196b具有促進(jìn)胰腺導(dǎo)管上皮癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力;HOX B6基因是hsa-mir-196b直接作用的下游靶基因,hsa-mir-196b可與HOX B6的3’-UTR區(qū)域結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮對HOX B6基因的直接抑制作用;HOX B6在胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞癌的表達(dá)明顯低于癌旁正常胰腺導(dǎo)管組織;HOX B6與胰腺的生存期明顯相關(guān),表達(dá)越高的患者預(yù)后越好。結(jié)論:1.本研究二代測序初步建立人胰腺癌及癌旁組織特異性差異miRNA表達(dá)譜,并為進(jìn)一步研究miRNA在胰腺癌中的作用提供了基礎(chǔ);分析驗證了hsa-mir-196b在胰腺癌組織中表達(dá)高于癌旁組織,且可能起到癌基因樣作用;2.首次證明了HOX B6在胰腺癌中起抑癌基因樣作用;3.首次證明胰腺癌中hsa-mir-196b是通過靶向調(diào)節(jié)下游HOX B6的表達(dá)并可能激活了ERK信號通路和P38信號通路促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷徙和侵襲發(fā)揮癌基因樣作用。
【圖文】：

miRNA-seq實驗路線圖

南京醫(yī)結(jié) 果RNA 的濃度及完整性檢測結(jié)果。樣本 RNA 的濃度經(jīng)分光光度計檢測：樣本 RNA 的 O-2.1 之間，且濃度介于 300~400ng/μl 之間；樣本 RNA 的完整性檢測：電泳時，可見 RNA 出現(xiàn) rRNA)，有時會有第三條條帶 (5S rRNA)，最上方未體 RNA 條帶未出現(xiàn)彌散，提示 RNA 的無降解（圖倍，比值在 1.7-2.0 之間，，說明各個樣本的 RNA 質(zhì)量，詳見表 1.1。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.9

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本文編號：2647644