發(fā)布時(shí)間：2020-05-02 17:40

【摘要】：胰腺癌是一種起病隱匿、發(fā)展迅速、預(yù)后極差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,由于其早期診斷困難,治療方法有限,因而死亡率與發(fā)病率幾乎一致[1,2]。在美國(guó),胰腺癌的死亡率已由第5位升至第4位,到2030年胰腺癌預(yù)計(jì)將成為第二大癌癥死亡原因[3]。最新的流行病學(xué)數(shù)據(jù)估計(jì),所有階段的胰腺癌的總體5年存活率僅為8.2%,是所有實(shí)體腫瘤中最低的。幾乎90%的胰腺惡性腫瘤都是胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)。盡管幾十年來(lái)外科手術(shù)和化療都取得了進(jìn)步,但PDAC患者的總體預(yù)后仍然非常差。與胰腺癌相關(guān)的最常見危險(xiǎn)因素包括吸煙,家族史,慢性胰腺炎,肥胖,糖尿病和職業(yè)危害[4-6]。由于缺乏有效的早期檢測(cè)篩查方法和極少的特定早期癥狀,絕大多數(shù)PDAC患者被診斷已為晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移。雖然手術(shù)提供了唯一可能的治愈性治療,但在診斷時(shí)只有15-20%的患者有可切除的機(jī)會(huì),甚至在進(jìn)行手術(shù)切除的患者中,大多數(shù)患者在一年內(nèi)發(fā)生疾病復(fù)發(fā)。因此,化療仍是胰腺癌輔助治療的重要手段之一[7]。吉西他濱(也稱為dFdC:2',2'-二氟脫氧胞苷)最初用于抗病毒,目前已被廣泛用作各種實(shí)體瘤和某些淋巴瘤的抗癌化療藥物。自1997年以來(lái),Burris等人發(fā)現(xiàn)吉西他濱可明顯改善患者癥狀、延長(zhǎng)患者中位生存期,吉西他濱已成為局部晚期和轉(zhuǎn)移性胰腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療選擇,并作為放療增敏劑在臨床廣泛使用,各種以該藥為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療方案正被廣泛開發(fā)。吉西他濱在表現(xiàn)狀態(tài)和疼痛控制方面優(yōu)于氟尿嘧啶(5-FU),與5-FU相比,吉西他濱的臨床受益反應(yīng)(CBR)更為深遠(yuǎn),幾乎高出五倍(23.8%對(duì)4.8%)[8]。然而,良好的臨床反應(yīng)無(wú)法轉(zhuǎn)化為生存獲益,可能至少部分歸因于在治療的幾周內(nèi),最初敏感的腫瘤發(fā)展出對(duì)吉西他濱化療耐藥性,使其對(duì)吉西他濱不再敏感[9]。因此,對(duì)調(diào)節(jié)吉西他濱敏感性的分子基礎(chǔ)進(jìn)行研究可能為增加這種化學(xué)療法的效率開發(fā)新的策略。這不僅會(huì)對(duì)胰腺癌患者有益,而且對(duì)吉西他濱治療的其他惡性腫瘤患者也有益。第一部分胰腺癌ADAM10的表達(dá)與吉西他濱敏感性的臨床研究目的:近期有研究表明解整合素樣金屬蛋白酶10(ADAM10)不僅參與腫瘤的增殖,血管生成,遷移和侵襲,還參與腫瘤的化療耐藥過(guò)程,本研究旨在檢測(cè)胰腺癌ADAM10的表達(dá)差異及其與患者對(duì)吉西他濱敏感性的相關(guān)性。方法:采用免疫組化的方法在胰腺癌患者腫瘤標(biāo)本中檢測(cè)ADAM10,VEGF以及CD31的蛋白表達(dá)水平,并分析ADAM10表達(dá)與VEGF以及微血管密度(MVD)的相關(guān)性。應(yīng)用Kaplan-Meier單因素生存分析和Cox多因素生存分析探索ADAM10表達(dá)水平與胰腺癌吉西他濱治療效率的相關(guān)性。結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示,ADAM10蛋白表達(dá)與微血管密度(p0.001)和VEGF表達(dá)(p0.001)均呈顯著正相關(guān)。ADAM10高表達(dá)組的MVD值顯著高于ADAM10低表達(dá)組(p0.001)。同時(shí),ADAM10在胰腺癌中的高表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)(p = 0.001),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p = 0.012),神經(jīng)周圍浸潤(rùn)(p = 0.022)和腫瘤,淋巴結(jié)和轉(zhuǎn)移分期(TNM)顯著相關(guān)(p = 0.029)。在單變量和多變量Cox回歸分析中,ADAM10是用吉西他濱輔助化療治療的胰腺癌患者總體生存率差和無(wú)病生存率低的獨(dú)立預(yù)后因素。結(jié)論:胰腺癌中ADAM10蛋白的表達(dá)與患者接受吉西他濱輔助化療的敏感性呈顯著負(fù)相關(guān)。第二部分胰腺癌吉西他濱耐藥株的建立與體外研究目的:本研究旨在建立胰腺癌吉西他濱耐藥的體外模型,作為研究ADAM10調(diào)節(jié)胰腺癌吉西他濱敏感性機(jī)制的工具。方法:采用吉西他濱濃度遞增培養(yǎng)法,建立人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞的吉西他濱耐藥株。通過(guò)MTT法測(cè)量細(xì)胞的存活率,實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,Western blot檢測(cè)耐藥相關(guān)基因MDR1蛋白以及ADAM10的表達(dá)。ELISA檢測(cè)PANC-1-GR及其親本細(xì)胞株分泌NKG2D配體可溶型蛋白(sMICA/B、sULBP1-3)水平。MTT法檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)PANC-1-GR及其親本細(xì)胞株的殺傷效率。通過(guò)siRNA基因沉默下調(diào)ADAM10表達(dá)后,檢測(cè)細(xì)胞分泌可溶型蛋白及對(duì)NK細(xì)胞殺傷敏感性。結(jié)果:建立吉西他濱耐藥株P(guān)ANC-1-GR細(xì)胞,與PANC-1親本細(xì)胞株相比較,PANC-1-GR細(xì)胞對(duì)吉西他濱耐藥,PANC-1-GR細(xì)胞對(duì)吉西他濱的半抑制濃度(IC50)為56.2±2.16μg/ml,而其親本細(xì)胞株P(guān)ANC-1的IC50為0.0060.003μg/ml。耐藥相關(guān)基因 MDR1(multidrugresistancel)在 PANC-1-GR細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加。PANC-1-GR細(xì)胞與親本株相比,增殖速度有所下降。PANC-1-GR細(xì)胞較PANC-1細(xì)胞高表達(dá)ADAM10,且細(xì)胞上清中見分泌MICA和ULBP2可溶型蛋白。PANC-1-GR細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷敏感性降低。對(duì)ADAM10進(jìn)行RNA干擾使其表達(dá)下調(diào),能夠恢復(fù)PANC-1-GR細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷的敏感性。結(jié)論:建立的PANC-1-GR株具有吉西他濱耐藥性,且高表達(dá)MDR1和ADAM10蛋白。ADAM10通過(guò)剪切分泌MICA和ULBP2可溶型蛋白,競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NKG2D活化受體,導(dǎo)致PANC-1-GR細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷發(fā)生逃逸。第三部分ADAM10調(diào)節(jié)胰腺癌吉西他濱敏感性的上游機(jī)制研究目的:本研究旨在尋找ADAM10調(diào)節(jié)胰腺癌吉西他濱敏感性的上游機(jī)制,尤其是環(huán)狀RNA-miRNA機(jī)制,以期尋找預(yù)測(cè)吉西他濱敏感性的血漿標(biāo)志物。方法:采用環(huán)狀RNA測(cè)序檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞PANC-1和其吉西他濱耐藥株P(guān)ANC-1-GR的差異circRNA譜。Q-PCR驗(yàn)證并篩選與吉西他濱敏感性密切相關(guān)的兩種環(huán)狀RNA。通過(guò)生物信息學(xué)分析,建立circRNA-miRNA結(jié)合網(wǎng)絡(luò)圖,篩選可能參與胰腺癌吉西他濱敏感性調(diào)節(jié)的miRNA。PANC-1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-145后,定量PCR檢測(cè)金屬蛋白酶的表達(dá)。結(jié)果:環(huán)狀RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)126中差異表達(dá)circRNA,其中68個(gè)circRNA在PANC-1-GR細(xì)胞中上調(diào),58個(gè)circRNA下調(diào)。定量PCR驗(yàn)證出兩個(gè)差異明顯的circRNA在PANC-1-GR細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),且該circRNA與患者對(duì)吉西他濱敏感性呈負(fù)相關(guān)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR145與兩種circRNA均具有結(jié)合能力。過(guò)表達(dá)miR145能夠抑制胰腺癌細(xì)胞中ADAM10和ADAM17的表達(dá),且PDAC患者血漿中miR145的表達(dá)與其對(duì)吉西他濱的反應(yīng)性呈正相關(guān)。結(jié)論:chr14:101402109-101464448+和 chr4:52729603-52780244+ 這兩種環(huán)狀RNA通過(guò)對(duì)miR145-5p的ceRNA機(jī)制,調(diào)節(jié)了金屬蛋白酶ADAM10和ADAM17的表達(dá),從而參與了對(duì)胰腺癌吉西他濱敏感性的免疫調(diào)控。
【圖文】：

圖２免疫組化結(jié)果判斷ＭＶＤ和ＡＤＡＭ１０之間的相關(guān)性逡逑

為進(jìn)一步證實(shí)ｍｉＲ－１４５參與吉西他濱敏感性的調(diào)節(jié)，我們對(duì)接受吉西他濱治逡逑療的ＰＤＡＣ患者血漿進(jìn)行定量ＰＣＲ檢測(cè)ｍｉＲ－１４５－５ｐ的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ｍｉＲ－１４５－５ｐ在逡逑吉西他濱無(wú)反應(yīng)組的表達(dá)水平低于吉西他濱有反應(yīng)組（圖１７）。逡逑４討論逡逑鑒于ｍｉＲＮＡ在胰腺癌吉西他濱耐藥過(guò)程中發(fā)揮的重要作用，而ｃｉｒｃＲＮＡｓ可逡逑能通過(guò)與ｍｉＲＮＡｓ相互作用參與吉西他濱耐藥，我們?cè)谶@項(xiàng)研宄中，比較了邋ＰＡＮＣ－１逡逑和ＰＡＮＣ－１－ＧＲ細(xì)胞之間ｃｉｒｃＲＮＡｓ表達(dá)譜的差異。通過(guò)對(duì)篩選出的兩個(gè)與吉西他逡逑濱反應(yīng)性顯著相關(guān)的兩個(gè)邋ｃｉｒｃＲＮＡ（邋ｃｈｒｌ４：邋１０１４０２１０９－１０１４６４４４８＋和邋ｃｈｒ４：逡逑５２７２９６０３－５２７８０２４４＋）進(jìn)行ｃｉｒｃＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，，發(fā)現(xiàn)二者均與逡逑ｍｉＲ－１４５具有結(jié)合能力。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的ｍｉＲ－１４５調(diào)節(jié)多種金屬蛋白酶的表達(dá)，我逡逑們推測(cè)ｃｉｒｃＲＮＡｓ通過(guò)ｍｉＲ１４５－５ｐ－ＡＤＡＭ１０通路調(diào)節(jié)了胰腺癌細(xì)胞的免疫調(diào)控及逡逑對(duì)吉西他濱敏感性調(diào)節(jié)。逡逑５結(jié)論逡逑１，通過(guò)ｃｉｒｃＲＮＡ測(cè)序，分析了邋ＰＡＮＣ－１－ＧＲ細(xì)胞及其親本細(xì)胞株的差異ｃｉｒｃＲＮＡ，逡逑并選擇差異最顯著的十個(gè)ｃｉｒｃＲＮＡ進(jìn)行ＰＣＲ驗(yàn)證。逡逑２，通過(guò)對(duì)接受吉西他濱化療的ＰＤＡＣ患者的血漿進(jìn)行ｑＲＴ－ＰＣＲ分析，發(fā)現(xiàn)逡逑ｃｈｒ１４：１０１４０２１０９－１０１４６４４４８＋，ｃｈｒ４：５２７２９６０３－５２７８０２４４＋與患者對(duì)吉西他濱的反逡逑應(yīng)性呈負(fù)相關(guān)。逡逑３
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.9

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7 林pせ

本文編號(hào)：2647323