【摘要】：目的近年來甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)發(fā)病率持續(xù)升高。雖然大部分PTC分化程度高、預后良好,但仍有一部分會復發(fā)及遠處轉移,嚴重影響患者的健康。此外,部分對傳統(tǒng)的化療藥物不敏感的患者往往也有著不良的預后。因此,目前急需尋找新的藥物治療靶點。本研究旨在尋找新的有望成為PTC治療靶點的PTC標志物。方法采用手術切除的經(jīng)病理診斷確診的6例PTC患者的癌癥組織及鄰近的正常甲狀腺組織,通過無標記定量蛋白質(zhì)組學技術分析蛋白質(zhì)表達情況,鑒定出癌癥組織與正常甲狀腺組織的差異表達蛋白,并通過生物信息學對差異表達蛋白進行功能注釋及通路分析。通過生物信息學分析從差異表達蛋白中選取了具備成為PTC標志物可能性的PDZ-LIM結構域蛋白5(PDZ and LIM domain 5,PDLIM5)和PDZ-LIM結構域蛋白1(PDZ and LIM domain 1,PDLIM1),以及已被證實在PTC中呈高表達的S100鈣結合蛋白A11(S100 calcium binding protein A11,S100A11),在臨床組織樣本中采用Western blot和qRT-PCR進行表達驗證。采用定量斑點印跡分析(Quantitative dot blot analysis,QDB)技術在75對臨床組織樣本中對PDLIM5和PDLIM1的蛋白質(zhì)表達水平進行檢測,并對結果進行ROC曲線分析�；赗OC曲線分析與蛋白質(zhì)的表達水平以及qRT-PCR結果,選擇在轉錄水平與蛋白水平穩(wěn)定高表達的PDLIM5確定為候選標志物進行深入研究。用IHC技術分析PDLIM5蛋白在PTC癌組織與正常甲狀腺組織樣本中的表達,統(tǒng)計分析IHC檢測的PDLIM5的表達量與病人性別、年齡、腫瘤大小、以及淋巴結轉移之間的關系。采用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術在PTC細胞系上降低PDLIM5蛋白的表達,通過實時細胞增殖實驗、平板克隆形成實驗、細胞劃痕遷移實驗和Transwell侵襲實驗檢測沉默PDLIM5后對PTC細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響,以探討PDLIM5作為PTC治療靶標的潛在價值。通過Western blot檢測沉默PDLIM5表達對PTC中重要的通路Ras/ERK信號通路中相關信號通路蛋白Ras、Raf-1和p-ERK1/2蛋白以及侵襲轉移相關蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein 9,MMP-9)表達的影響,以探尋PDLIM5在PTC中作用的可能機制。結果通過高通量高分辨率質(zhì)譜分析,我們在PTC篩選到了2788種蛋白質(zhì),比以往任何一種在PTC中進行質(zhì)譜分析的得到的蛋白質(zhì)數(shù)量都要多。其中,49種蛋白質(zhì)在PTC患者腫瘤組織與正常甲狀腺組織中表達具有顯著性差異。在PTC組織中高表達的有44種,在正常甲狀腺組織中高表達的有5種。通過生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)這些異常表達的蛋白質(zhì)主要是細胞骨架蛋白與核酸結合蛋白,說明骨架蛋白在PTC的發(fā)生中起著重要作用。其分子功能主要是蛋白結合功能,主要參與促性腺激素釋放受體信號通路與細胞周期信號通路。生物信息學分析結果顯示,骨架蛋白PDLIM5和PDLIM1具有成為PTC標志物的潛質(zhì)。對PTC患者的癌組織與正常甲狀腺腺體組織中的PDLIM5和PDLIM1以及已知在PTC組織中高表達作為對照的S100A11蛋白,進行Western blot驗證,結果顯示這三種蛋白在癌組織中表達均較正常甲狀腺組織中顯著性升高;qRT-PCR驗證結果顯示PTC組織中PDLIM5、PDLIM1和S100A11 mRNA的相對表達量(3.07±0.41,1.65±0.35,3.68±1.05)均顯著性高于正常腺體組織。Western blot與qRT-PCR結果與質(zhì)譜分析結果相一致,證實了我們高通量高分辨率質(zhì)譜分析的有效性。為了進一步研究PDLIM5及PDLIM1在PTC中的蛋白相對表達量,我們采用QDB技術在75對臨床樣本中進行蛋白檢測。結果顯示,有54例PTC樣本癌組織中PDLIM5蛋白呈顯著性高表達,56例PTC組織中PDLIM1蛋白呈顯著性高表達。受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)曲線分析結果顯示,PDLIM5的AUC是0.87(P0.001;95%CI 0.817-0.927),PDLIM1的AUC為0.70(P0.001;95%CI 0.61-0.78),PDLIM5在PTC中的靈敏度與特異性更好。結合Western blot與qRT-PCR結果,PDLIM5蛋白從轉錄水平到蛋白表達水平在PTC癌組織中均呈顯著性高表達且表達穩(wěn)定更具成為PTC生物標志物的潛質(zhì)。對PTC組織進行PDLIM5蛋白的IHC檢測結果顯示,PDLIM5主要分布于胞漿中,細胞膜上也有部分分布。統(tǒng)計分析表明,78例PTC患者標本中有62例(79.5%)癌組織的PDLIM5蛋白表達量顯著性高于其對照的正常甲狀腺組織。進一步對PDLIM5蛋白的表達與患者病理特征的統(tǒng)計學分析結果顯示,PDLIM5的表達與腫瘤的大小呈正相關,與患者的年齡、性別、淋巴結轉移不相關。在PTC細胞株中敲除PDLIM5表達后,可以顯著性地抑制細胞增殖、遷移及侵襲能力。敲低PDLIM5表達后,相關通路蛋白表達分析結果顯示:Ras/ERK信號通路中的Ras、Raf-1和p-ERK1/2蛋白的表達顯著性下調(diào),侵襲轉移相關蛋白MMP-9蛋白表達水平也呈顯著性降低。結論:我們通過高通量高分辨率質(zhì)譜分析結合生物信息學分析并通過在臨床樣本中進行驗證,篩選出具備成為PTC標志物潛質(zhì)的PDLIM5。其在臨床組織樣本中呈高表達并與PTC的發(fā)生發(fā)展相關,在PTC細胞系中敲低PDLIM5可以抑制細胞的惡性生物學行為。因此,PDLIM5具有作為PTC治療靶標的潛在價值。
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圖 1.1 質(zhì)譜分析鑒定出的蛋白質(zhì)左邊是火山圖，，右邊為鑒定出的部分蛋白質(zhì)的熱點圖ig1.1 Proteins identified through proteomics. The left fig:Volcano plot illustrated significantifferential abundant proteins from the quantitative analysis. The -log10 (P value) is plottedagainst the log2 (fold Cancer/Normal). The red dots indicate proteins with significantlyfferent expression between PTC and normal thyroid tissue（sP<0.05）. The black dots indicateroteins not significantly different. The right is heatmap generated by hierarchical clusteringof proteins identified表 1.4 甲狀腺癌組織與正常甲狀腺組織的差異表達蛋白Tab1.4 Differential expressed proteins between PTC tissues and normal thyroid tissues（Triplicate experiments of 6 pairs of tissue）tein IDs Protein Names P value RatioQ99460 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 1 3.51E-3 5.43P00352 Retinal dehydrogenase 1 4.27E-3 0.62

30圖 1.2 差異表達蛋白的蛋白分類、細胞組分、分子功能和生物學過程Fig1.2 Global protein profiling of differentially expressed proteins between PTC tissuesand normal thyroid tissues. GO analysis of (a) cellular components (b) molecularfunction (c).biological processes and (d) protein class 信號通路注釋結果通過檢索發(fā)現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)主要參與到 14 個代謝通路（圖 1.3）。這些通路
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R736.1

【參考文獻】

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1 惠娟;王建業(yè);史曉紅;張耀光;劉銘;王鑫;王娜娜;陳鑫;梁思穎;魏東;趙帆;張毓洪;楊澤;;PDLIM5、SLC22A3和NKX3-1基因與前列腺癌患病風險的關聯(lián)性研究[J];中華男科學雜志;2012年05期

本文編號：2642372