【摘要】：目的:研究顯示2型糖尿病患者發(fā)生大腸癌的機(jī)率較高,且2型糖尿病與大腸癌的發(fā)生及發(fā)展有密切關(guān)系,探討影響2型糖尿病合并大腸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,有利于找尋糖尿病合并大腸癌的治療靶點(diǎn)。精氨酸特異性單ADP核糖轉(zhuǎn)移酶1(ART1)是重要的單ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶,與細(xì)胞的多種生物學(xué)行為有關(guān)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),2型糖尿病合并大腸癌患者癌組織中ART1的表達(dá)高于無(wú)2型糖尿病的大腸癌患者的癌組織,提示ART1可能在2型糖尿病合并的大腸癌中具有調(diào)節(jié)作用。此外,有研究報(bào)道,β-石竹烯可調(diào)節(jié)MIN6胰島細(xì)胞的ADP核糖基化因子6(Arf6)引起葡萄糖刺激的胰島素分泌,且β-石竹烯還可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。在高糖環(huán)境下,β-石竹烯是否可通過(guò)抑制ART1對(duì)大腸癌細(xì)胞的糖酵解及增殖、凋亡產(chǎn)生影響,尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題旨在先前的研究基礎(chǔ)上,探討β-石竹烯是否可抑制ART1促進(jìn)的糖酵解影響大腸癌細(xì)胞增殖和凋亡;同時(shí)探討β-石竹烯抑制ART1促進(jìn)的糖酵解可能的分子機(jī)制,為糖尿病合并大腸癌靶向治療的選擇提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:本研究分為兩部分:1.β-石竹烯抑制ART1促進(jìn)的糖酵解影響大腸癌增殖和凋亡(1)高糖環(huán)境下ART1對(duì)大腸癌CT26細(xì)胞糖酵解及增殖、凋亡的影響1)高糖環(huán)境下ART1對(duì)大腸癌CT26細(xì)胞乳酸及ATP含量的影響采用乳酸測(cè)定試劑盒及ATP檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)高糖環(huán)境下培養(yǎng)的ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞(ART1-cDNA組)、ART1沉默CT26細(xì)胞(ART1-shRNA組)培養(yǎng)上清液中乳酸含量及細(xì)胞內(nèi)ATP含量。(空載體轉(zhuǎn)染的CT26細(xì)胞(LV-control組)及未轉(zhuǎn)染的CT26細(xì)胞(Un-transfected組)為對(duì)照組)2)ART1對(duì)糖尿病Balb/c小鼠大腸癌CT26細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)的影響腹腔注射煙酰胺(NA)和鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病Balb/c小鼠模型,在糖尿病Balb/c小鼠右側(cè)腋窩皮下分別接種四組CT26細(xì)胞建立移植瘤模型,觀測(cè)ART1對(duì)糖尿病小鼠移植瘤的影響,并用Western blot檢測(cè)各組移植瘤中凋亡蛋白Cleaved caspase3、Bax的表達(dá)變化。(2)β-石竹烯在高糖環(huán)境下對(duì)ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞增殖及凋亡的影響1)高糖環(huán)境下β-石竹烯對(duì)ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞乳酸及ATP的影響高糖環(huán)境下,β-石竹烯(50μmol/l)處理ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞后,應(yīng)用乳酸測(cè)定試劑盒及ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞乳酸及ATP的變化。2)高糖環(huán)境下β-石竹烯對(duì)ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞增殖及凋亡的影響采用CCK8實(shí)驗(yàn),流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst33258凋亡染色檢測(cè)β-石竹烯對(duì)ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞增殖及凋亡的影響。3)β-石竹烯對(duì)糖尿病小鼠ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞移植瘤的影響β-石竹烯處理接種了ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞的糖尿病Balb/c小鼠,觀察β-石竹烯對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的影響,并用Western blot檢測(cè)移植瘤組織中凋亡蛋白Cleaved caspase3、Bax的表達(dá)情況。2.β-石竹烯抑制ART1促進(jìn)的糖酵解的分子機(jī)制(1)高糖環(huán)境下,ART1對(duì)大腸癌CT26細(xì)胞糖酵解酶及相關(guān)因子的影響1)Western blot檢測(cè)高糖環(huán)境下ART1對(duì)CT26細(xì)胞中AKT、P-AKT、MTOR、P-MTOR、C-MYC的表達(dá)和糖酵解酶PDK1、LDHA蛋白表達(dá)的影響。2)Western blot檢測(cè)糖尿病小鼠CT26細(xì)胞移植瘤中MTOR、P-MTOR、PDK1、LDHA蛋白表達(dá)情況。(2)高糖環(huán)境下,β-石竹烯對(duì)ART1、糖酵解酶及相關(guān)因子的影響1)Western blot檢測(cè)β-石竹烯對(duì)ART1表達(dá)的影響。2)Western blot檢測(cè)β-石竹烯對(duì)ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞中AKT、P-AKT、MTOR、P-MTOR、C-MYC、PDK1、LDHA蛋白表達(dá)的影響。3)Western blot檢測(cè)β-石竹烯對(duì)糖尿病小鼠CT26細(xì)胞移植瘤組織中MTOR、P-MTOR、PDK1、LDHA蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:1.β-石竹烯抑制ART1促進(jìn)的糖酵解影響大腸癌增殖和凋亡(1)高糖環(huán)境下ART1對(duì)大腸癌CT26細(xì)胞糖酵解及增殖、凋亡的影響1)高糖環(huán)境下ART1對(duì)大腸癌CT26細(xì)胞乳酸及ATP含量的影響高糖環(huán)境下,與空載組和未轉(zhuǎn)染組CT26細(xì)胞比較,ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞乳酸和ATP含量增加,ART1沉默的CT26細(xì)胞乳酸和ATP含量降低(P0.05)。2)ART1對(duì)糖尿病Balb/c小鼠大腸癌CT26細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)及凋亡的影響糖尿病移植瘤模型中,與未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染空載組比較,ART1高表達(dá)組移植瘤的體積和重量均增加(P0.05),ART1沉默組體積和重量均減少(P0.05);Western blot檢測(cè)四組移植瘤凋亡蛋白Cleaved caspase3和Bax在ART1高表達(dá)組降低(P0.05),在ART1沉默組增高(P0.05)。(2)β-石竹烯在高糖環(huán)境下對(duì)ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞增殖及凋亡的影響1)高糖環(huán)境下β-石竹烯對(duì)ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞乳酸及ATP的影響與未采用β-石竹烯處理的ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞相比,經(jīng)過(guò)β-石竹烯處理后ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞的乳酸和ATP含量降低(P0.05)。2)高糖環(huán)境下β-石竹烯對(duì)ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞增殖及凋亡的影響CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示:隨著β-石竹烯的濃度及時(shí)間增加,ART1高表達(dá)的CT26細(xì)胞增殖活性降低;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期:β-石竹烯誘導(dǎo)后,ART1高表達(dá)的CT26細(xì)胞G1期比例增高,S期比例減少,PI指數(shù)減少(P0.05);流式細(xì)胞儀及Hoechst 333258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡:β-石竹烯誘導(dǎo)后,ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞凋亡增加(P0.05)。3)β-石竹烯對(duì)糖尿病小鼠ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞移植瘤的影響β-石竹烯處理糖尿病小鼠ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞移植瘤模型后,結(jié)果顯示β-石竹烯處理組移植瘤的體積減小,重量降低;同時(shí)Western blot檢測(cè)顯示β-石竹烯處理組移植瘤中凋亡蛋白Cleaved caspase3和Bax表達(dá)增高(P0.05)。2.β-石竹烯抑制ART1促進(jìn)的糖酵解的分子機(jī)制(1)高糖環(huán)境下,ART1對(duì)大腸癌CT26細(xì)胞糖酵解酶及相關(guān)因子的影響1)Western blot檢測(cè)高糖培養(yǎng)后的四組CT26細(xì)胞,結(jié)果顯示:與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載組相比,在ART1高表達(dá)組中,P-AKT,P-MTOR,C-MYC蛋白及糖酵解酶PDK1和LDHA蛋白表達(dá)增加(P0.05),而在ART1沉默組中降低(P0.05),其中AKT,MTOR在四組細(xì)胞中表達(dá)無(wú)明顯差異(P0.05)。2)Western blot檢測(cè)四組糖尿病小鼠CT26細(xì)胞移植瘤蛋白結(jié)果顯示:P-MTOR,PDK1和LDHA蛋白表達(dá)在ART1高表達(dá)組增高(P0.05),在ART1沉默組降低(P0.05);而MTOR蛋白的表達(dá)在四組間無(wú)明顯差異(P0.05)。(2)高糖環(huán)境下,β-石竹烯對(duì)ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞糖酵解酶及相關(guān)因子的影響1)Western blot結(jié)果顯示:β-石竹烯處理ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞及糖尿病小鼠移植瘤后均可導(dǎo)致ART1表達(dá)降低(P0.05),同時(shí)用PDTC處理ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞也可抑制ART1的表達(dá)(P0.05)。2)Western blot檢測(cè)高糖環(huán)境下β-石竹烯處理的ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞,結(jié)果顯示:P-AKT,P-MTOR,C-MYC蛋白及糖酵解酶PDK1和LDHA蛋白表達(dá)降低(P0.05),但AKT,MTOR的表達(dá)無(wú)明顯變化(P0.05)。3)Western blot檢測(cè)β-石竹烯處理的糖尿病小鼠ART1高表達(dá)CT26細(xì)胞移植瘤,結(jié)果顯示:移植瘤蛋白中P-MTOR,PDK1和LDHA表達(dá)降低(P0.05),MTOR的表達(dá)無(wú)明顯變化(P0.05)。結(jié)論:β-石竹烯可抑制高糖環(huán)境下大腸癌細(xì)胞的增殖和凋亡,其可能通過(guò)抑制ART1,進(jìn)而抑制由ART1促進(jìn)的AKT/MTOR/C-MYC通路介導(dǎo)的糖酵解而實(shí)現(xiàn)。ART1在大腸癌的糖酵解中扮演著重要的角色,β-石竹烯在抗糖尿病合并的大腸癌患者治療中可能具有重要作用,詳盡機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
【圖文】：

β-石竹烯的結(jié)構(gòu)

ART1 對(duì) CT26 細(xì)胞糖尿病 Balb/c 小鼠移 瘤重量及體RT1 on the weight and volume of transplanted tumors o糖尿病 Balb/c 小鼠移植瘤凋亡水平的影響植瘤的組織蛋白，Western Blot檢測(cè)各組蛋白中C變化，結(jié)果顯示：與未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染空載組相比pase3、Bax 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；ART1 沉蛋白表達(dá)增高（P＜0.05）；未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空白表達(dá)無(wú)明顯差異（P>0.05）（圖 1.2）；
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R587.1;R735.34

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2642642